Определение титра вируса по инфекционной активности.

Наиболее универсальным для титрования практически любого вида вируса принято считать метод определения титра в единицах 50%-ного инфекционного действия. В этом методе за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у пятидесяти процентов (т.е. у половины) зараженных тест-объектов (живые системы). Эта доза вируса обозначается как ЭД₅₀ – эффективная 50 %-ная доза.

Инфекционный титр вируса – это количество ЭД₅₀ в единице объёма материала (1,0 мл).

Выбор учёта инфекционной активности вирусов по 50 %-ному эффекту действия на живые системы, как видно из графика (рис. 22), связан с тем,   что   кривая   зависимости   инфекционного   эффекта  от дозы вируса

Рис. 22 График зависимости инфекционного эффекта от дозы вируса

вблизи точки, соответствующей ЭД50  на значительном отрезке приближается к прямой. Это означает, что в пределах данного отрезка величина инфекционного эффекта пропорциональна логарифму дозы вируса (или его разведению), тогда как в области малых и больших доз вирусов эта зависимость нарушается.

В качестве тест-объектов обычно используют лабораторных животных, куриные эмбрионы и культуру клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться летальностью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим действием (эффектом) соответственно. Для титрования определённого вида вируса используют только чувствительный к нему вид тест-объект и учитывают характерные формы проявления инфекционного действия (эффект действия) вируса в нём. И в соответствии с этим выбирают обозначение ЭД₅₀ (табл.6).

 

 

Таблица 6

Виды обозначений ЭД₅₀ при титровании вируса

по 50%-ному инфекционному действию

 

Тест-объекты	Виды инфекционного действия вируса	Единицы количества вируса
		название единиц	обозначение ЭД50[2]
Лабораторные животные	летальность	50%-ная летальная доза	ЛД50
	клинические симптомы (патологоанатомические изменения)	50%-ная летальная доза	ИД50
Куриные эмбрионы	летальность	50%-ная летальная доза	ЭЛД50
	патологоанатомические изменения	50%-ная летальная доза	ЭИД50
Культура клеток	цитопатическое действие (эффект)	50%-ная цитопатическая доза	ЦПД50 ЦПЭ50

 

Количество ЭД₅₀ (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ЦПД₅₀) вируса, содержащееся в единице объема материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале.

Например, Т_{(титр вируса бешенства)} = 10^4,0 ЛД ₅₀/мл означает, что 1,0 мл материала содержится 10^4,0 или 10000,0 доз вируса бешенства, каждая из которых способна вызвать летальный эффект у 50 % зараженных этим материалом белых мышей.

Титрование вируса в единицах ЭД₅₀ сводится к тому, чтобы найти такое разведение вируссодержащего материала, в котором содержалась бы одна ЭД₅₀. А затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объёме вируссодержащего материала. Это и будет показателем титра вируса.

Методика титрования вируса по 50 %-ному эффекту

1 Готовят ряд последовательных 10-кратных разведений из исследуемого вируссодержащего материала.

2 Заражают равные группы тест-объектов, чувствительных к вирусу, одинаковыми объёмами каждого из 10-кратных разведений вируссодержащего материала. При этом в каждой группе тест-объектов должно быть чётное количество живых систем, но не менее четырёх, т.к. при меньшем количестве статистически рассчитываемая величина титра вируса будет иметь слишком большую погрешность (статистическая величина тем точнее, чем на большем количестве исходных данных она основана).

3 Учитывают результат действия вируса в зависимости от выбранных тест-объектов (гибель, клинические симптомы, патологоанатомические изменения или ЦПД).

4 Определяют, в каком разведении вирус проявил своё действие на 50-ти процентах тест-объектов.

5 Вычисляют, сколько ЭД₅₀ вируса содержится в единице объёма (1,0 мл) вируссодержащего материала, что и будет выражением титра вируса в исследуемом материале.

В разведении вируса, дающем 50 %-ный эффект, содержится 1 ЭД_50. Следовательно, в таком же объёме исходного (неразведённого) вируссодержащего материала ЭД₅₀ содержится больше во столько раз, во сколько был разведен материал до дозы равной 1 ЭД_50.

В таблице 7 представлен пример титрования вируса ньюкаслской болезни на куриных эмбрионах по летальности.

Таблица 7

Пример титрования вируса по 50 % - ной инфекционной активности

Разведения вируса	1:10 (10^-1)	1:10^2 (10^-2)	1:10^3 (10^-3)	1:10^4 (10^-4)	1:10^5 (10^-5)	1:10^6 (10^-6)
Этапы титрования вируса
1 Готовят последовательные 10-кратные разведения вируса ньюкаслской болезни (ВБН)
2 Каждым разведением ВБН заражают по 4 куриных эмбриона в объёме 0,2 мл на эмбрион. За заражен-ными объектами наблюдают
3 Учёт результатов заражения проводят по летальности «+» – есть летальность «–» – нет летальности	Результат 1
	+ + + +	+ + + +	– + + +	– – + +	– – – +	– – – –
	Результат 2
	+ + + +	+ + + +	– + + +	– + + +	– – – +	– – – –

 

Летальность куриных эмбрионов в первые 48 час. после заражения принимают за неспецифическую и в расчет не берут. По окончании срока инкубации (для ВБН – 3-4 дня) проводят учёт результатов заражения.

Результат 1. Как видно из таблицы 8 вирус в разведении 1:10⁴ (10^-4) вызывал гибель половины (50 %) куриных эмбрионов в группе. Следовательно, титр вируса в этом разведении был равен 1 ЭЛД₅₀ в объёме 0,2 мл. Таким образом, титр исходного (неразведённого) вируса ньюкаслской болезни в заражающей дозе будет равен:

Т = 1 • 10⁴ ЭЛД₅₀ / 0,2 мл.

Так как инфекционный титр вируса обычно рассчитывают в объёме 1,0 мл вируссодержащего материала, то окончательное значение титра вируса будет равно:

Т = 5 • 10⁴ ЭЛД₅₀ / 1,0 мл.

Результат 2. Как видно из таблицы 7, далеко не всегда можно получить 50 % - ный эффект действия в группе тест – объектов. В таком случае необходимо расчетным путём найти такое разведение вируса, которое вызывает гибель 50 % куриных эмбрионов. С этой целью используют статистические методы, их которых наиболее часто используют метод Кербера.   

Данные результата 2 по титрованию ВБН, представлены в таблице 8.

Таблица 8

Данные результатов титрования ВБН

Разведение вируса	Кол-во тест–объектов в группе (n)	Результат по летальности  (r)
1:10 (10^-1)	4	4
1:10^2(10^-2)	4	4 (r5)
1:10^3(10^-3)	4	3 (r4)
1:10^4(10^-4)	4	3 (r3)
1:10^5(10^-5)	4	1 (r2)
1:10^6(10^-6)	4	0 (r1)

 

Для расчета ЭЛД₅₀ вируса ВБН используем формулу Кербера в модификации Р.В. Белоусовой с соавторами (2006):

lg ЭД ₅₀ = lg D + lg d / 2 – lg d • Σ r / n

где D – наибольшее разведение вируса, в котором вирус ещё вызывает 100 % –ный эффект действия; d – коэффициент разведения вируса; Σr / n – отношение суммы положительно реагирующих тест – объектов (Σr = r ₁ + r ₂ + r ₃ + …. r_n), дающих эффект действия от 0 до 100 %, к количеству этих объектов в каждой группе (n).

Так как ВБН в разведениях и 10^-1, и 10^-2 вызывает один и тот же 100 % - ный эффект летальности, то выбирают наибольшее из этих двух разведений вируса, а именно – 10^-2. Данные табл.9 подставляем в формулу Кербера:

lg ЭЛД₅₀ = lg 10^-2 + lg 10 / 2 – lg 10 • Σ (0+1+3+3+4) / 4

lg ЭЛД₅₀ = –2 + 1 /2 – 1• 11/4

lg ЭЛД₅₀ = –4,25

Таким образом, в 0,2 мл ВБН, разведённого в 10^-4,25 или 1:10^4,25_,  содержится 1 ЭЛД₅₀ этого вируса. В том же объёме  неразведённого ВБН таких доз будет больше в 10^4,25 раз, а в объёме 1,0 мл больше ещё в пять раз.

Т = 5• 10^4,25 ЭЛД₅₀ / мл.

В вирусологической практике, кроме инфекционных единиц 50 % – ного действия вируса на тест – объекты, инфекционный титр выражают в инфекционных единицах локальных повреждений, вызываемых вирусом. Локальные повреждения оценивают по единичному эффекту действия вируса. К таким повреждениям относятся бляшки (очаги лизиса) в заражённой культуре клеток и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов. В случаях такого проявления инфекционной активности количество вируса может оцениваться в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ): 1БОЕ – доза вируса, способная вызвать образование одной бляшки; 1ООЕ – доза вируса, способная вызвать образование одной оспины.

Метод титрования вируса по БОЕ даёт наиболее достоверные данные о концентрации вирусов (многие вирусы в культуре клеток образуют бляшки), но он имеет технические трудности, связанные с получением и подсчётом бляшек. Титрование вирусов по ООЕ ограничено тем, что небольшой процент вирусов вызывает образование оспин на ХАО.

Методика титрования вируса по локальным повреждениям:

1 Одинаковыми объёмами вируссодержащего материала заражают несколько матрасов с культурой клеток или куриных эмбрионов на ХАО.

2 Инкубируют в соответствующих условиях и проводят учёт локальных повреждений.

3 Подсчитывают, сколько бляшек образовалось в каждой культуре клеток под агаровым покрытием или сколько оспин на ХАО образовалось в каждом курином эмбрионе.

4 Рассчитывают среднее арифметическое количества бляшек или оспин, которое равно количеству БОЕ или ООЕ вируса, содержащееся в заражающей дозе материала.

5 Рассчитывают титр вируса (Т) по следующей формуле:

Т = n / (V • a),

где n – среднее арифметическое количества бляшек на один матрас или оспин на один куриный эмбрион; V – объём заражающей дозы вируса; a – разведение вируссодержащего материала.

Пример 1. Необходимо определить титр бычьего аденовируса в культуральной суспензии.

Вируссодержащий материал предварительно развели в 100 раз (1:100) и внесли по 0,1 мл в 5 матрасов с монослоем клеток. Через 48-72 часа инкубации удалили питательную среду и внесли агаровое покрытие. После кратковременной инкубации под агаровым покрытием провели подсчёт бляшек методом световой микроскопии.

Количество бляшек в матрасах оказалось равным 7, 9, 7, 10, 8 соответственно. Среднее арифметическое составило:n = 7+9+7+10+8 / 5 = 8,2. Исходя из того, что V = 0.1 и разведение a = 0,01 (1:100), получаем значение титра:

Т = 8,2 / (0,1 • 0,01) = 8200

Таким образом, титр вируса оказался  равным 8200 БОЕ в 0,1 мл. Значит в каждом миллилитре материала будет содержаться в десять раз больше доз аденовируса с Т = 82000 БОЕ /мл, каждая из которых способна вызвать образование одной бляшки в культуре клеток.

При титровании вирусов по локальным повреждениям следует учитывать, что при высокой концентрации вируса в материале бляшки в культуре клеток или оспины на ХАО могут сливаться между собой, что затрудняет их подсчёт. Учитывают бляшки или оспины, если их количество не превышает 50 на один матрас или ХАО одного эмбриона.

Чтобы избежать слияния бляшек или оспин перед заражением готовят несколько последовательных разведений материала (обычно с коэффициентом 10) и каждым разведением в одинаковых дозах заражают равные группы тест – объектов. После инкубации рассчитывают среднее арифметическое количества бляшек или оспин для каждого разведения вируса, не учитывая те локальные изменения, подсчёт которых оказался невозможным. Титр вируса тогда рассчитывают по формуле:

Т = n₁ + n₂ + n₃ + …n_n  / V•(a₁ + a₂ + a₃ +...a_n)

Пример 2. Результаты титрования  вируса оспы голубей на ХАО куриных эмбрионов приведены в таблице 9.

Таблица 9

Результаты титрования по ООЕ

Разведение вируса (а)	Объём заражающей дозы (V) в мл	Среднее арифметическое оспин на один куриный эмбрион (n)
1: 10 (0,1)	0,2	45
1:100 (0,01)	0,2	17
1:1000 (0,001)	0,2	2

 

Подставляем значения из табл.9 в формулу:

Т = 45+17+2 / 0,2 •(0,1+0,01+0,001)= 64 / 0,0222 = 2883 ООЕ / 0,2 мл

Титр вируса в в 0,2 мл материала составил 2883 ООЕ. Значит в каждом миллилитре будет содержаться в пять раз больше доз вируса оспы голубей с Т = 14414 ООЕ /мл, каждая из которых способна вызвать образование одной оспины на ХАО куриного эмбриона.

Материальное обеспечение: диагностические задачи по определению инфекционного титра вируса (приложение 1).

Примерный план занятия (2 часа)

1 Проведение тестирования студентов 

2 Объяснение преподавателя по теме занятия.

3 Самостоятельная работа студентов по решению диагностической задачи по определению инфекционного титра вируса_.

4 Подведение итогов занятия

5 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1 В каких целях проводят титрование вирусов?

2 В каких единицах оценивают инфекционную активность вируса?

3 От чего зависит обозначение ЭД₅₀ при титровании вируса по 50%-ному инфекционному действию?

4 Что такое инфекционный титр вируса?

5 Как рассчитывают титр вируса по локальным патологическим изменениям?