Краткие теоретические сведения

Требования при работе с вируссодержащим материалом. Работа с вируссодержащим материалом должна проводиться в соответствие с тремя основными требованиями. Во-первых, запрещено распространение вирусов в окружающую среду; во-вторых, не допускается контаминации (обсеменение) вируссодержащего материала посторонней микрофлорой; в-третьих, требуется соблюдать личную безопасность.

Устройство вирусологической лаборатории. Для выполнения данных требований с вирусами работают в специализированных вирусологических лабораториях (отделах), где проводят исследования по выделению вирусов из биологического материала и объектов окружающей среды, определению видов вирусных антигенов и их свойств, обнаружению противовирусных антител в сыворотки крови и других биологических жидкостях и др. исследования. Структура таких лабораторий и виды деятельности проводимые в них должны соответствовать "Санитарно-эпидемиологическим требованиям к устройству и условиям работы микробиологических, вирусологических и паразитологических лабораторий" (СанПин) и определяться поставленными перед ними задачами.

Вирусологическая лаборатория (отдел) должна располагаться в отдельном здании, где обеспечиваться полная биологическая безопасность, направленная на защиту работающего персонала, населения и окружающей среды от воздействия вирусов и других патогенных биологических агентов (ПБА).

Лаборатория должна иметь централизованный водопровод, канализацию, электро- и газоснабжение, центральное отопление и горячее водоснабжение, вентиляцию, боксы с механической приточно-вытяжной вентиляцией, виварий, автоклавную. В лаборатории должно быть два входа – один для персонала, другой – для материала, поступающего на исследование. При входе для персонала предусматривается санитарный пропускник.

Помещения лаборатории должны иметь естественное и искусственное освещение. В комнате, где проводится работа с люминесцентным микроскопом, фотокомнате, душевых, санитарных узлах, складских помещениях может быть не предусмотрено естественное освещение. Оконные переплёты боксов должны выполняться с применением уплотняющих прокладок. Пол, стены, потолок должны быть гладкими, легко моющимися, устойчивыми к действию дезинфицирующих средств; полы - не скользкими. Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых.

Если в помещениях лаборатории проводят работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность вирусами, относящимися к I и II группам патогенности, то они имеют три зоны – "заразную", "условно – чистую",  и "чистую".

 В "заразной" зоне все исследования проводятся в системе сообщающихся между собой боксов безопасности – специальных герметичных конструкциях для проведения исследований в стерильных условиях. Боксы должны быть обозреваемыми (через стеклянные двери или боковые стены) и иметь предбоксники с раковиной для мытья рук и емкостями с дезинфицирующими растворами. Вход в "заразную" зону осуществляется через санитарный пропускник с душевой или шлюз, где одевается защитная одежда – пижамы из хлопчатобумажной ткани, стерильные халаты, косынки, маски. Во время работы в шлюзе должна быть включена бактерицидная лампа. При входе в "заразную" зону должен быть устанавлен проходной автоклав с автоматической блокировкой дверей.

 Аварийная звуковая или световая сигнализация должна быть выведена из боксов в помещение, где постоянно находится персонал.

В боксированных помещениях проводят заражение и вскрытие лабораторных животных; центрифугирование, ультразвуковую дезинтеграцию материала и другие операции, сопровождающиеся образованием мелкодисперсных аэрозолей; заражение культуры клеток и куриных эмбрионов; приготовление вируссодержащей суспензии; серологические исследования с живыми вирусами; работу по ведению коллекционных штаммов вирусов, лиофилизации вирусов и другие виды исследований.

В лаборатории должен быть виварий, где содержатся и размножаются разные виды лабораторных животных с последующей передачей их для проведения исследований.
 Отходы из помещений лаборатории обеззараживают погружением в дезинфицирующий раствор, автоклавированием или сжиганием. Запрещается сливать не обеззараженные жидкости в канализационную сеть, а твердые отходы – в контейнеры для твёрдых отходов.

"Чистая" зона состоит из помещений лаборатории, куда не должен поступать материал, зараженный или подозрительный на зараженность вирусами и другими микроорганизмами.

При работе в вирусологической лаборатории необходимо неукоснительно соблюдать правила асептики и антисептики.

Асептика – система мероприятий и приёмов работы, предупреждающих попадание микроорганизмов и вирусов из окружающей среды в организм человека, а также исследуемый материал. Она предусматривает использование стерильного инструментария и материалов, защиту рук персонала.

Антисептика – комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов и вирусов, способных вызывать инфекционный процесс при попадании на повреждённые или интактные участки кожи и слизистых оболочек. С этой целью используют антисептические препараты.

Дезинфекция – обеззараживание объектов окружающей среды путём уничтожения патогенных для человека и животных микроорганизмов и вирусов физическими (УФ-облучение, фламбирование поверхностей и др.) и химическими (дезинфицирующие вещества) методами. Выбор и концентрация дезинфицирующих веществ зависит от материала, подлежащего дезинфекции.

Стерилизация – система мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов и вирусов (обеспложивание) в различных материалах. Стерилизацию проводят физическими и химическими методами.

Правила работы с вируссодержащим материалом. Студент на лабораторных занятиях должен выполнять следующие правила работы:

1 Входить в помещение лаборатории и выходить из него необходимо только в спецодежде (лабораторный халат, бахилы).

2 В помещении лаборатории запрещено пить и принимать пищу. На рабочем столе не должно быть никаких посторонних предметов, в том числе мобильных телефонов и других электронных устройств.

3 Работу с вирусами проводить в специально отведённых замкнутых пространствах – боксах (ламинарный бокс).

Ламинарный бокс – лабораторный прибор для работы с биологическими объектами в стерильных условиях. Представляет собой шкаф, оборудованный осветителями, ультрафиолетовыми лампами и системой подачи стерильного воздуха.

4 В боксе все работы с вирусами проводить в лабораторном халате с длинным рукавом и застегнутыми манжетами, шапочке, медицинской марлевой маске и перчатках.

5 Все виды работы в боксе выполнять вблизи пламени горелки.

6 При работе с вирусами использовать только стерильные расходные материалы: инструментарий, лабораторную посуду, растворы и др.

7 Не допускать образование мелкодисперсных аэрозолей.

8 После окончания работы все жидкие отходы поместить в дезинфицирующий раствор; твёрдые отходы – в контейнеры (биксы) для последующего автоклавирования или другого метода стерилизации; инструментарий – в стерилизаторы для кипячения; стеклянную и одноразовую пластиковую посуду и другие расходные материалы погрузить в дезинфицирующий раствор. Рабочую поверхность стола обработать дезинфицирующим раствором. Воздух в боксовом помещении простерилизовать бактерицидной лампой. Руки после работы обработать специальным дезинфицирующим средством для рук или промыть щелочным мылом.

9 Запрещено выливать или сбрасывать отходы в общую канализацию без предварительной дезинфекции (см. п.8).

10 В случае непредвиденной ситуации, например, студент разлил вируссодержащий материал, необходимо немедленно сообщить об этом преподавателю и провести дезинфекционные мероприятия.

Основные методы консервации вирусов. Вирус, обладающий высокой инфекционной активностью, требуется для проведения лабораторного исследования патологического материала от животных при подозрении на вирусную болезнь, для биотехнологических работ по изготовлению противовирусных вакцин, для получения вирусных антигенов и гипериммунной противовирусной сыворотки, а также для разных видов научных исследований. Все эти виды деятельности требуют сохранения вируса в условиях лаборатории на тот или иной период времени в зависимости от поставленной цели.

Существуют физические и химические методы консервации вируса. Например, низкие температуры от +4° до минус 70°С позволяют сохранять вирус от нескольких недель до нескольких лет. При этом, чем ниже температура, тем длительнее срок консервации вируса.

Ещё более продолжительное консервирующее действие оказывает быстрое замораживание вируса до минус 196°С (жидкий азот), что обеспечивает сохранение его инфекционной активности сроком до десяти лет и более.

В настоящее время активно используют метод лиофильного высушивания вируса под вакуумом из замороженного состояния. При этом необходимо учитывать, что лиофилизат вируса в дальнейшем хранят при температуре не выше 4°С.

Из химических консервантов, обладающих не только стабилизирующим, но и бактериостатическим действием, более эффективен 50 % – ный раствор глицерина[1] на физиологическом растворе. Такой способ консервации обеспечивает сохранение активности вируса при 4°С в течение месяца.

Материальное обеспечение занятия: ламинарный бокс, термостат, холодильник, центрифуга, лабораторная посуда, микроскопы, журнал по технике безопасности.

Примерный план занятия (2 часа)

1 Знакомство со студентами, обсуждение вопросов по организации учебного процесса.

2 Объяснение преподавателя по теме занятия.

3 Демонстрация боксированного помещения и лабораторного оборудования.

4 После проведения первичного инструктажа по работе с вирусами, каждый студент ставит подпись в журнале по технике безопасности.

5 Подведение итогов занятия

6 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1  Что такое вирус?

2 Какие требования и правила работы с вирусом Вы знаете?

3 Какие существуют методы консервации вирусов?

4 Что такое асептика, антисептика, дезифекция и стерилизация?

5 Как организована вирусологическая лаборатория?

Тема 2 Отбор, транспортировка и подготовка патологического   материала для вирусологического исследования

Цель занятия: ознакомиться с требованиями и основные правилами при отборе патологического материала от животных, его хранении и транспортировки в лабораторию; с видами патологического материала; методами подготовки патологического материала к вирусологическому исследованию.

Вирусологическое исследование сводится к обнаружению (индикация), выделению (изоляция) виру­са из патологического материала и его идентификации (установление вида вируса).

Патологическим материалом следует считать материал, полученный от больных или павших животных, в котором предположительно находится возбудитель (вирус) болезни или антитела против данного возбудителя.

Патматериал, доставленный в лабораторию, условно считают первичным, т.е. он получен непосредственно от больных или павших животных.

Главное требование к патологическому материалу – вирус в нём должен сохраниться в максимальной концентрации. Это достигается соблюдением следующих правил:

– от больных животных патологический материал отбирают в острый период болезни на фоне выраженных клинических симптомов, от павших и вынужденно убитых - не позднее одного - двух часов с момента гибели или убоя («правило времени»);

– патологический материал отбирают из тех органов, где развивался патологический процесс, с учётом тропизма вируса («правило место»);  

– отбор патологического материала проводят с соблюдением правил асептики и антисептики: используют одноразовый стерильный инструментарий; контейнеры с этикетками, на которых указывают вид материала и вид или инвентарный номер животного; растворы антибиотиков широкого спектра действия и противогрибковых препаратов);

От больных животных и подозрительных в заражении вирусом, отбирают различные виды патологического материала.

Смывы со слизистых оболочек носа, конъюнктивы глаз, ротовой полости, задней стенки глотки, половых органов, прямой кишки, клоаки у птиц (например, при подозрении на вирусные пневмоэнтериты КРС, трансмиссивный гастроэнтерит свиней, грипп птиц и др.) берут ватно-марлевым тампоном или жёстким одноразовым зондом и помещают во флакон с транспортной средой  (физиологический раствор, рН 7,0-7,2 с антибиотиками).

Кровь цельную для выделения вируса (например, при подозрении на лейкоз КРС и др.) берут из ярёмной или вены хвоста одноразовыми системами для взятия крови (например, вакуумные системы). Обнаружить вирус в крови возможно в период вирусемии при генерализованных вирусных инфекциях (чума КРС, классическая и африканская чума свиней, катаральная лихорадка овец и др.).

Для определения динамики титра антител кровь на парные пробы сыворотки берут дважды: во время яркого проявления клинических признаков и через две недели в период выздоровления (реконвалесценция). Исследование проводят одномоментно после доставки второй пробы в лабораторию.

Поражённые участки кожи и слизистых оболочек (например, стенки папул или корочки при подозрении на оспу; стенки афты при ящуре; стенки папул или пустул при кожной форме чумы плотоядных) снимают пинцетом или иссекают скальпелем и помещают в стерильные контейнеры.

Фекалии (например, при подозрении на ротавирусную или коронавирусную инфекции и др.) отбирают непосредственно из прямой кишки шпателем и помещают в стерильный контейнер.

Мочу отбирают катетером и помещают в стерильный контейнер.

Везикулярную жидкость и слюну собирают шприцем или пастеров­ской пипеткой и помещают в стерильный контейнер.

Спинномозговую жидкость берут асептическим способом путем пункции по стандартной методике.

От трупов, подозрительных в заражении вирусом, отбирают небольшие пробы патологического материала весом не более 5 – 10 гр.

К ним относятся:

– изменённые  ткани органов;

– ткань паренхиматозных органов (печени, почек, селезёнки);

– лимфатические узлы региональные, расположенные рядом с изменённой тканью;

– ткань органов без видимых патологических изменений, в которых согласно патогенезу предполагаемой болезни  возможно обнаружить вирус

(например, абортированные плоды и плодные оболочки при инфекционном ринотрахеите КРС; головной мозг при болезни Ауэски и ньюкаслской болезни; голову при бешенстве и т. д).

Патологический материал во влагонепроницаемой таре помещают в термос со льдом или хладагентом, для кусочков тканей органов можно использовать консервирующий раствор. Например, 50%-ый глицерин на физиологическом растворе. Однако, такую смесь не рекомендуют использовать для консервации кусоч­ков тканей органов, которые в дальнейшем предполагают исследовать методом иммунофлуоресценции.

В лабораторию патологический материала вместе с сопроводительным документом доставляют не позднее 4-х часов с момента его взятия. В сопроводительном письме указывают название (юридический адрес) хозяйства, фермы или отделения, клиники; вид животных; предварительный диагноз; количество проб; дату и фамилию ветеринарного врача; название (юридический адрес) ветеринарной лаборатории,

Подготовка патологического материала к исследованию. В лаборатории из патологического материала (его принято считать первичным), готовят вируссодержащую суспензию. Однако, небольшое количества материала от каждой пробы замораживают и хранят до окончания экспертизы для дополнительных исследований (если это будет необходимо).

1 Приготовление вируссодержащей суспензии из тканей органов:

–  ткани измельчают и перетирают в фарфоровой ступке;

–  готовят 10% суспензию на фосфатном буфере или растворе Хэнкса;

–  центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут;

 –  надосадочную жидкость отбирают и добавляют  антибиотики широкого спектра действия;

–  материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро;

–  при отрицательном результате бактериологического контроля проводят исследование вируссодержащей суспензии; в случае положительного бактериологического контроля суспензию дополнительно обрабатывают антибиотиками и повторно ставят контроль.

До проведения исследования суспензию хранят при температуре минус 20-70°С.

2 Приготовление вируссодержащей суспензии из смывов, соскобов:

–  тампон отполаскивают в транспортной среде, отжимают;

–  центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут;

 – надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия;

–  материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро;

– при отрицательном результате бактериологического контроля проводят исследование вируссодержащей суспензии; в случае положительного бактериологического контроля суспензию дополнительно обрабатывают антибиотиками и повторно ставят контроль.

– осадок можно исследовать  в серологических реакциях ИФА, РИФ и др.

 До проведения исследования суспензию хранят при температуре минус 20-70°С.

3 Приготовление вируссодержащей суспензии из фекалий:

– фекалии гомогенизируют в фосфатно-буферном растворе;

– центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут:

 – надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия;

– материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро.

– при отрицательном результате бактериологического контроля проводят исследование вируссодержащей суспензии; в случае положительного бактериологического контроля суспензию дополнительно обрабатывают антибиотиками и повторно ставят контроль.

До проведения исследования суспензию хранят при температуре минус 20-70°С.

4 Приготовление вируссодержащей суспензии из кожных поражений:

– стенки папул, корочки растирают с фосфатно-буферным раствором;

– центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут;

 надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия;

– материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро.

– при отрицательном результате бактериологического контроля проводят исследование вируссодержащей суспензии; в случае положительного бактериологического контроля суспензию дополнительно обрабатывают антибиотиками и повторно ставят контроль.

До проведения исследования суспензию хранят при температуре минус 20-70°С.

5 Кровь цельную с антикоагулянтом замораживают. После оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия и подвергают бактериологическому контролю.

6 Для получения проб сыворотки кровь без антикоагулянтов выдерживают при комнатной температуре (или в термостате) до образования сгустка, обводят сгусток для отделения от стенок, помещают в холодильник на 18-20 час, затем отбирают сыворотку стерильно, добавляют антибиотики широкого спектра действия. Хранят при температуре +4° С или замораживают.

Материальное обеспечение: стерилизатор с инструментарием (ножницы, пинцеты, тампоны), контейнеры для отбора и транспортировки патологического материала, термоконтейнер с хладагентами, термос со льдом, кусочки печени КРС в пенициллиновых флаконах, физиологический раствор, антибиотики, фарфоровая ступка с пестом, стерильный кварцевый песок, механический дозатор, одноразовые наконечники, центрифуга, холодильник, термостат.

Примерный план занятия (2 часа)

1 Проведение тестирования студентов 

2 Объяснение преподавателя по теме занятия.

3 Демонстрация: а) инструментария, контейнеров, тампонов для отбора патологического материала, термоконтейнеров для транспортировки патологического материала;

б) приёмов взятия смывов со слизистой оболочки носа, конъюнктивы, прямой кишки у животных; в) приготовления вируссодержащей суспензии из патологического материала.

4 Подведение итогов занятия

5 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1 Что такое патологический материал?

2 Какие требования и правила предъявляют при отборе патологического материала?

3 Какие существуют методы консервации патологического материала?

4 Какие виды патологического материала отбирают от больных животных?

5 Какие виды патологического материала отбирают от павших животных?

6 Как проводят подготовку патологического материала к вирусологическому исследованию?