Тема 3 формы существования вирусов. Индикация вирусов по вирионам и внутриклеточным тельцам-включениям

Цель занятия: изучить формы существования вирусов у животных; ознакомиться с методами индикации вирусов по вирионам и внутриклеточным тельцам-включениям.

Вирусы могут находиться в организме хозяина вне клетки и внутри клетки. Первую форму существования вирусов принято называть внеклеточной, вторую – внутриклеточной.

Внеклеточная форма вирусов представляет собой корпускулы, т.е. частицы различной формы (сферической, кубической, пулевидной и др.), которые называют  вирионами, а также элементарными тельцами или вирусными частицами. Это зрелая, но не активная, а значит, не репродуцирующаяся вирусная частица, В этой форме вирусы локализуются вне клетки, сохраняют  свою инфекционную активность, проникают  из клетки в клетку, а также из одного организма в другой.

Вирионы вирусов обнаруживают методом электронной микроскопии. Однако для вирионов самых крупных вирусов (семейство Poxviridae) используют и метод световой микроскопии.

Метод электронной микроскопии позволяет по тонким деталям ультраструктуры вириона обнаруживать и описывать только некоторые характеристики вируса. Например, такие как, форма вириона, его размер, тип симметрии, наличие пеплоса (суперкапсид) с пепломерами (отростки), число капсомеров.  Для этого делают микрофотографии.

Перед проведением электронной микроскопии готовят специальные препараты. С этой целью вируссодержащий материал суспендируют и наносят на специальную сетку с подложкой из коллодия или чистого углерода, который слабо поглощает электроны. Для увеличения электронной плотности препарата его обрабатывают парами окиси осмия. Кроме этого используют методы напыления на препарат тяжёлых металлов (золото, палладий и др.), которые хорошо подчёркивают форму вирусных частиц, т.к. глубоко проникают в поверхностные структуры вириона. Конфигурация вирионов отчётливо отпечатывается на матрицах-репликах из пластмасс, раствором которых заливают препарат. Симметрию и распределение белковых субъединиц в вирионах изучают с помощью рентгеноструктурного анализа.

Примеры электронных микрофотографий вирионов отдельных вирусов представлены в таблице 1.

Обнаружение вирионов вирусов в материале от больных (павших) животных методом электронной микроскопии не даёт возможности идентифицировать вирус и установить окончательный диагноз, так как разные виды вирусов одного семейства имеют схожие морфологические особенности вириона. Кроме того, этот метод остаётся технологически сложным и дорогостоящим, что не позволяет его широко использовать в диагностике вирусных болезней животных.

Таблица 1

Электронные микрофотографии вирионов вирусов

Семейство Reoviridae	Семейство Flaviviridae	Семейство Coronaviridae
Форма – сферическая. Тип симметрии – кубический. Размер – 60-80 нм. Число капсомеров – 122. Капсидная оболочка трёхслойная. Суперкапсид отсутствует.	Форма – сферическая. Тип симметрии – кубический. Размер – 40-60 нм. Вирион имеет суперкапсид.	Форма – сферическая. Тип симметрии – спиральный. Размер – 120-160нм. Вирион имеет суперкапсид с отростками.
Семейство Оrthomyxoviridae	Семейство Rhabdoviridae	Семейство Retroviridae
Форма – сферическая (или плеоморфная). Тип симметрии – спиральный. Размер – 80-120 нм. Вирион имеет суперкапсид с отроками.	Форма – пулевидная. Тип симметрии – спиральный. Размер – 100-430 х 45-100 нм. Вирион имеет суперкапсид с отростками.	Форма – сферическая. Тип симметрии – кубический. Размер – 80-100 нм Вирион имеет суперкапсид с отростками.
Семейство Poxviridae	Семейство Herpesviridae	Семейство Adenoviridae
Форма – параллелепипеда. Тип симметрии – сложный. Размер 220-450 х 140-260 нм. Вирион имеет суперкапсид с отросткками (филоменты).	Форма – сферическая. Тип симметрии – кубический. Размер – 100-110 нм. Число капсомеров – 162. Вирион имеет суперкапсид.	Форма – сферическая Тип симметрии – кубический. Размер – 70-90 нм Число капсомеров – 240. Капсид имеет отростки – фиберы. Вирион не имеет суперкапсида..

 

Метод световой микроскопии используется только для индикации вирионов вирусов оспы, т.к. они имеют размеры от 300 до 450 нм (самые крупные вирусы). На рис. 1 представлены вирионы вируса оспы птиц в мазке из ХАО, окрашенном по М.А. Морозову.

На предметных стёклах готовят мазки-отпечатки с участка кожи или слизистой оболочки с оспенным поражением (на стадии папулы или везикулы) и окрашивают методом серебрения по М.А. Морозову.

Методика окрашивания по М.А. Морозову

I Готовят реактивы № 1, 2, 3 непосредственно перед окрашиванием.

Реактив № 1 – жидкость Руге: 1,0 мл уксусной кислоты, 2,0 мл 40 % - ного раствора формальдегида, 100,0 мл дистиллированной воды соединить в одном флаконе.

Реактив № 2 – протрава: 5,0 г танина растворить в 100,0 мл дистиллированной воды и добавить 1,0 мл карболовой кислоты (фенол). К смеси добавить 5,0 мл эфира. Смесь не должна мутнеть в течение часа.

Реактив № 3 – раствор аммиачного серебра: растворить 5,0 г кристаллического азотнокислого серебра в 100,0 мл дистиллированной воды. Добавить по каплям 25 % - ный раствор аммиака до получения опалесцирующего раствора. Полученный раствор развести дистиллированной водой в соотношении 1:10. Хранить в темном флаконе с притёртой пробкой.

II Окрашивание

1 Препарат обрабатывают раствором № 1 в течение 3-5 мин., промывают дистиллированной водой 

2 Опускают в раствор № 2 и одновременно прогревают (до появления паров) в течение 1-2 мин., промывают дистиллированной водой

3 Наносят реактив № 3 и нагревают по появления тёмно-коричневой окраски (1-2 мин.). Тщательно отмывают дистиллированной водой, сушат на воздухе.

III Световая микроскопия

На готовый мазок наносят каплю иммерсионного масла и просматривают под большим увеличением.

Результат: на жёлтом фоне видны мелкие тёмно-коричневые округло-овальной формы образования, лежащие в виде отдельных скоплений или диффузно по всему мазку. Эти образования получили название элементарных телец (вирионы вируса оспы).

Рис. 1 Вирионы вируса оспы в мазке, окрашенном по М.А. Морозову

Метод световой микроскопии оспенных вирусов простой и доступный. Однако, недостатками его являются невозможность дифференцировать разные виды вирусов семейства Poxviridae, а также то обстоятельства, что не всегда возможно отличить вирионы от сходных по форме элементов самой клетки.

Внутри клетки (внутриклеточная форма) вирусы могут находиться  на любой стадии репродукции - репродуцирующаяся активная вегетативная вирусная частица, в форме провируса и дефектного интерферирующего вируса (ДИ-частица или ДИЧ).

Провирус – это вирусная нуклеиновая кислота (ДНК), интегрированная в геном клетки (клеточная ДНК). В этой форме вирус может длительно сохраняться в клетках хозяина (персистенция) и передаваться по наследству при вертикальном способе заражения. При определённых условиях, благоприятных для репродукции вируса (например, снижение иммунной защиты у хозяина и др.), с провируса запускаются процессы транскрипции, трансляции и репликации вирусных компонентов, что заканчивается сборкой и выходом вириона из клетки в инфекционно-активной форме.

Дефектные интерферирующие вирусы представляют собой вирионы, у которых есть дефект в геномной РНК или ДНК, однако структурные белки остаются такими же, как у родительских вирусов. Репликации ДИ-частиц без родительских вирионов не происходит в результате утраты ими инфекционной активности (дефекты в геноме). Однако, при совместном заражении клеток ДИ-частицами и полноценными вирионами, последние являются вирусами-помощниками или хелперами. ДИ-частицы используют для своего воспроизведения генные продукты вируса-помощника. Используя для своей репликации продукты генов хелпера, ДИ-частицы угнетают репродукцию самого вируса-помощника, что в вирусологии называют интерференцией (лат «inter» –взаимно, «ferio» –подавлять), отсюда и название – дефектные интерферирующие частицы. 

При репродукции многих вирусов в клетках могут появляться внутриклеточные образования, которые называют тельцами-включениями. Они могут локализоваться в ядре или цитоплазме клетки и называться ядерными или цитоплазматическими. В основном они представляют собой скоплениями вирусных нуклеопротеидов или отдельных компонентов вирионов (например, вирусные белки), а также их комбинацией. Это так называемые вирусные тельца-включения. В других случаях это могут быть скопления элементов самой клетки, изменившихся в результате репродукции вируса,  так называемые клеточные тельца-включения. И, наконец, могут формироваться  скопления из вирусных и клеточных компонентов -смешанные тельца-включения.

Размер телец-включений колеблется от едва различимых в световом микроскопе до размеров клеточного ядра, а их количество – от одного до 10-12 на одну клетку. Тельца-включения, образуемые в клетках при репродукции некоторых вирусов, очень часто имеют специальные названия (по фамилии автора, впервые его описавшего). Например, при репродукции вируса бешенства в цитоплазме нервных клеток обнаруживают тельца Бабеша–Негри; вируса оспы птиц в цитоплазме клеток кожи и эпителия – тельца Боллингера; вируса чумы плотоядных в цитоплазме многих клеток – тельца Лентца; вируса инфекционного ларинготрахеита кур в ядре эпителиальных клеток – тельца Зейфреда и др.

Чаще всего при репродукции РНК – геномных вирусов обнаруживают цитоплазматические, а ДНК – геномных – ядерные тельца-включения. Но есть вирусы, которые при репродукции образуют тельца-включения обоих типов, например, вирус кори.

Внутриклеточные тельца-включения в вируссодержащем материале можно обнаружить методом световой микроскопии, что, однако, не позволяет провести идентификацию вируса, а значит, установить его вид, и является лишь вспомогательным методом лабораторного исследования.

Материальное обеспечение: хориоаллантоисная оболочка от куриных эмбрионов, заражённых вакцинным штаммов вируса оспы голубей; обезжиренные предметные стёкла; пинцеты, газовые горелки, чашки Петри; реактивы №№ 1, 2, 3; иммерсионное масло, дистиллированная вода; световые микроскопы с осветителями.

Примерный план занятия (2 часа)

1 Проведение тестирования студентов 

2 Объяснение преподавателя по теме занятия.

3 Демонстрация: а) методика приготовления мазка, б) методика окрашивания по М.А. Морозову

4 Самостоятельная работа студентов: а) приготовление мазка, б) окраска мазков по М.А. Морозову, в) микроскопия мазков, г) рисунок по результатам микроскопии.

4 Подведение итогов занятия

5 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1 В каких формах вирусы находятся в организме животных?

2 Каким методом обнаруживают внеклеточную форму вирусов?

3 Что можно изучить о вирусе на основании электронной микрофотографии?

4 Что такое провирус?

5 Что такое ДИ-частица?

6 Какие бывают тельца-включения? Метод их обнаружения?