Тема 10 титрование вирусов по гемагглютинирующей активности

Цель занятия: овладеть методом титрования вирусов по гемагглютинирующей активности.

Некоторые вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты определённых видов животных. Титр таких вирусов определяют в количественной реакции гемагглютинации (РГА) и выражают в гемагглютинирующих единицах (ГАЕ).

За 1 ГАЕ принимают такую дозу вируса, которая способна агглютинировать около 50 % эритроцитов (реакция на два креста), взятых в равных с вирусом объёмах.

Методика титрования гемагглютинирующих.

Рассмотрим на примере титрования вирусаньюкаслской болезнив количественной РГА. Реакцию ставят микрометодом в 96-луночных планшетах (таблица 10).

1 Готовят ряд последовательных двукратных разведений вируссодержащего материала в равных объёмах (по 50,0мкл).

2 Ко всем разведениям вируса добавляют 1,0 %-ную суспензию эритроцитов петуха в таком же объёме.

3 Одновременно ставят контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию. Для этого в одну из лунок вносят в равных объёмах (по 50,0мкл) физиологический раствор и 1,0 %-ную суспензию эритроцитов петуха.

4 Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15-20 мин.

5 Процент агглютинации эритроцитов оценивают по шкале (таблица 11).

 6 Определяют титр вируса в ГАЕ.

Таблица 10

Протокол титрования вируса ньюкаслской болезни

по гемагглютинирующей активности

 

№№ лунок планшета	1	2	3	4	5	6	7
Разведение ВБН	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	К эр.*
Физиологический раствор, мкл)	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0
ВБН, мкл	50,0	Последовательный перенос по 50,0 **
1,0% суспензия эритроцитов петуха (мкл)	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0
Контакт 25-30 минут при комнатной температуре
Учёт реакции	+++	+++	+++	++	++	–	–

* – К эр. – контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию

** – из лунки (№6) с последним разведением вируса (1:64) удаляют 50,0 мкл вируссодержащего материала

Таблица 11

Шкала %  агглютинации эритроцитов

 

 

а) 75 -100% эритроциты агглютинированы вирусом и образовали равномерную взвесь с ровным краем – «полный зонтик» (реакция на три «креста»)
б) в среднем 50 % эритроцитов агглютинированы вирусом и образуют равномерную взвесь меньшего диаметра, остальные - образуют осадок в центре лунки в виде диска или в виде «пуговки» – «неполный зонтик» (реакция на два «креста»)
в) в среднем 25% эритроцитов агглютинированы вирусом и образуют неравномерную взвесь малого диаметра с неровным краем; большая часть эритроцитов образует плотный осадок в центре лунки  в виде «пуговки» – «маленький зонтик» (реакция на один крест)
г) все эритроциты (100%) не агглютинированы и образуют осадок центре лунки в виде «пуговки»

 

Наибольшее разведение вируссодержащего материала, в котором агглютинация эритроцитов ещё оценивается не менее, чем на два креста, содержит 1ГАЕ вируса. В таком же объёме неразведённого материала гемагглютинирующих единиц вируса будет больше во столько раз, во сколько раз развели материал и получили разведение с 1 ГАЕ вируса.

В нашем примере, если за наибольшее разведение вируса ньюкаслской болезни, в котором  гемагглютинация оценивается ещё на два креста, мы принимаем 1:32 (большее из двух), то это означает, что в 50,0 мкл этого вируса разведённого в 32 раза содержится 1 ГАЕ. Соответственно в таком же объёме не разведенного вируссодержащего материала гемагглютинирующих единиц больше в 32 раза.

Т = 32 ГАЕ

Так как суспензию эритроцитов и вируссодержащий материал берут в равных объёмах, то не важно, на какой объём материала будет приходиться 32 ГАЕ, т.к. с увеличением объёма одного компонента во столько же раз увеличивается объём другого.

Другими словами, если соотношение гемагглютинирующих белков вируса в смеси с 1,0% – ой суспензией эритроцитов при изменении их объёмов не изменяется (1:1), значит, не изменяется и число ГАЕ.

Материальное обеспечение: аллантоисная жидкость куриных эмбрионов, заражённых вакцинным штаммом вируса ньюкаслской болезни; 1,0 %-ная суспензия эритроцитов петуха; 96-луночные планшеты; физиологический раствор; механические дозаторы и одноразовые наконечники к ним; сосуды с дезраствором.

Примерный план занятия (2 часа)

1 Проведение тестирования студентов 

2 Объяснение преподавателя по теме занятия.

3 Демонстрация методики количественной РГА.

4 Самостоятельная работа студентов по постановке количественной РГА, учёту результата и определению ГАЕ вируса.

4 Подведение итогов занятия

5 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1 В каких единицах оценивают гемагглютинирующую активность вируса?

2 Что принимают за гемагглютинирующий титр вируса?

3 Как проводят учёт результата количественной РГА?