Тема 13 Реакция диффузионной преципитации (РДП)

Цель занятия: изучить реакцию диффузионной преципитации; овладеть методикой постановки реакции.

Реакция диффузионной преципитации (РДП) или реакция иммунной диффузии (РИД) основана на способности молекул антигенов и антител  диффундировать между молекулами агарового геля. Если АГ и АТ специфичны друг другу, то они связываются (комплекс АГ–АТ) и образуют осадок – преципитат. Результат реакции учитывают только визуально по обнаружению в агаровом геле линии преципитации белого цвете. Для этого лучше использовать яркий источник света в затемненном помещении.

РДП в ветеринарной практике используют в диагностики бешенства, лейкоза крупного рогатого скота, болезни Марека, инфекционной анемии лошадей и др.

Реакция относится к экспресс – методом диагностики, очень простая и не требует стерильности в выполнении. Однако, обладает низкой чувствительностью, в связи с чем не всегда представляется возможным визуально обнаружить преципитат в агаровом покрытие. Именно поэтому специфические антигены и антитела, используемые в реакции, должны находиться в достаточной концентрации, чтобы можно было с высокой степенью вероятности выявлять линии преципитации.

Методика постановки РДП

1 Готовят 1,0 %-ный раствор агара на дистиллированной воде и нагревают его на водяной бане в течение 60-90 минут до образования коллоидного раствора (золь);

2 Наливают раствор расплавленный агара ровным слоем на предметное стекло (или чашку Петри), расположенное на горизонтальной поверхности, сначала по периметру, а потом быстро заполняя середину стекла. Толщина агара должна не превышать 1,5–2,0 мм. Не допускать образования пузырей и волн в слое агара. Оставить при комнатной температуре до затвердевания агарового покрытия (агаровый гель).

2 Вырезают в агаре лунки с диаметром 5,0 мм (2,0 мм – для микрометода РДП) на расстоянии 3,0 мм друг от друга. Для этого можно использовать либо специальные штампы для РДП, представляющие собой трубочки одинакового диаметра с остро заточенными краями, расположенные на одной плоскости и на одинаковом расстоянии друг от друга (рис. 29), либо самостоятельно изготовленные бумажные трафареты, количеством лунок, расположенными строго в соответствии с оригинальным штампом. Такой трафарет помещают под стекло с застывшим агаровым гелем и с помощью любой трубки заданного диаметра вырезают лунки.

Количество и расположение лунок определяется диагностической задачей.

3 Вносят в лунки компоненты реакции (АГ, АТ). При этом лунка должна быть полностью заполнена. Одновременно с исследуемыми пробами в лунки вносят положительные контроли – антиген специфический и сыворотка специфическая, и отрицательные контроли, не содержащие вирусных антигенов (например, физиологический раствор) и специфических противовирусных антител (например, сыворотка крови от здорового донора).

Предметные стёкла помещают во влажную камеру на инкубацию в течение 6 – 12 – 24 – 48 – 72 час. при температуре +37°С.

Через 48-72 часа препараты можно высушить и окрасить раствором амидного чёрного, что позволяет сохранять результат реакции длительное время и создаёт возможность документирования результата путём фотографирования.

4 Проводят учёт результата РДП визуально по линии преципитации.

                                          а              б              в

Рис. 29 Штампы для РДП: а) используется в диагностике бешенства; б) используется для постановки РДП макрометодом (Ø лунки =5,0 мм); в) используется для постановки РДП микрометодом (Ø лунки =2,0 мм).

 

РДП используют для индикации и идентификации вируса, для обнаружения и определения титра антител в сыворотке крови.

Материальное обеспечение: обезжиренныепредметные стёкла, 1%-ный раствор агара Дифко, гильзы патрона калибра 5,6 мм, перья ученические с ручками, сыворотка крови положительная, сыворотка крови отрицательная, антиген положительный, антиген отрицательный, механические дозаторы одноканальные с одноразовыми наконечниками; расходные материалы.

Примерный план занятия (2 часа)

1 Проведение тестирования студентов 

   2 Объяснение преподавателя по теме занятия

3 Демонстрация преподавателя  

4 Самостоятельная работа студентов: а) формирование агарового покрытия на предметном стекле; б) изготовление трафарета из бумаги; в) вырезание лунок в слое агара; г) внесение компонентов реакции в лунки: д) учёт результатов РДП через 24 час.

5 Подведение итогов занятия

6 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1 В чём принцип реакции диффузионной преципитации?

2 По какой методике ставят РДП?

3 В чём достоинства и недостатки РДП?