Методика проведения ПЦР-анализа

ПЦР-анализ состоит из трёх этапов: выделения нуклеиновых кислот вируса, амплификации, детекции продуктов амплификации.

Подготовку проб проводят в соответствии с инструкцией к тест-системе.

Нуклеиновые кислоты вирусов выделяют из 100,0 мкл вируссодержащей суспензии с помощью комплекта для выделения ДНК.

Этап I - выделение ДНК вирусов

Цель выделения ДНК вируса– концентрирование в малом объёме (100,0 мкл), удаление ингибиторов ПЦР и получение очищенного препарата ДНК. Для этого 100,0 мкл подготовленной пробы помещают в лизирующий раствор для лизиса клеток и деструкции нуклеопротеидных комплексов. Затем ДНК сорбируют на сорбенте, проводят инактивацию эндогенных и экзогенных нуклеаз (ферменты, разрушающие нуклеиновые кислоты) и удаляют ингибиторы ПЦР путём трёхкратных отмывок. После элюции ДНК (десорбирование) получают очищенный препарат суммарной ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Этап II - постановка реакции амплификации

Предварительно готовят пробирки с реакционной смесью компонентов для постановки амплификации в соответствии с инструкцией к тест-системе.

Реакционная смесь состоит из следующих компонентов: буферного раствора, четырёх видов дезоксинуклеотидтрифосфатов, праймеров, ДНК-полимеразы, хлорида магния, исследуемого препарата суммарной ДНК. На поверхность реакционной смеси наносят каплю минерального масла для предотвращения её испарения. Объём реакционной смеси составляет 25,0 мкл.

Подготовленные пробирки помещают в лунки амплификатора, запускают программу в соответствии с инструкцией к тест-системе.

После окончания реакции пробирки готовы к анализу продуктов ПЦР методом горизонтального электрофореза.

Этап III - электрофоретический анализ продуктов ПЦР

Электрофоретический анализ продуктов ПЦР заключается в разделении фрагментов ДНК по молекулярной массе в агарозном геле.

Для этого готовят рабочий электрофорезный буфер и расплавляют агарозу. Агарозный гель заливают в форму электрофоретической камеры, устанавливают гребёнки для получения лунок и дают полностью застыть (30 минут при комнатной температуре).

Далее осторожно вынимают гребенки, не повредив лунки. Помещают подложку с готовым гелем в камеру. Лунки должны располагаться ближе к отрицательному электроду, т.к. ДНК перемещается  по направлению к положительному. Заливают в камеру готовый буфер так, чтобы он покрывал гель на 5,0 мм сверху.

После амплификации отбирают из пробирок по 10,0 – 15,0 мкл проб и вносят в лунки геля. В каждом ряду дорожек (трек) геля должен быть обязательно представлен положительный и отрицательный контроли.

После электрофореза переносят гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. При просматривании геля глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной.

Учёт и интерпретация результатов

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК. Учет следует начинать с результатов амплификации контролей. В дорожке, соответствующей положительному контролю, должна быть яркая специфическая светящаяся полоса на определённом уровне. В дорожках, соответствующих отрицательным контролям, такая полоса отсутствует.

Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности на том же уровне, что и полоса с положительным контрольным образцом ДНК. Отрицательными считаются пробы, в дорожках которых отсутствует специфическая полоса (рис.32).

1 2  3  4   5 6 7 8 9 10 11	Результаты ПЦР
	1- положительный контроль 2 - отрицательный контроль 3,6,7 – отрицательные пробы 4,5,8,9,10,11 – положительные пробы

 

Рис. 32 Электрофореграмма результатов ПЦР

Результаты анализа не учитывают, если в дорожке отрицательного контроля выявляется специфическая полоса. Возможно, произошла контаминация реактивов и (или) проб. В этом случае результаты анализа считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также принять меры по выявлению источника контаминации.

Материальное обеспечение: диагностическая тест-система для диагностики вирусных болезней животных методом ПЦР, настольный ПЦР-бокс, амплификатор, твердотельный термостат для пробирок типа «эппендорф» на 25 – 100° С, вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, микроцентрифуга для микропробирок типа «эппендорф» до 12 - 16 тыс. g, центрифуга/вортекс, камера для горизонтального электрофореза, источник постоянного тока с напряжением 150-460 В, ультрафиолетовый трансиллюминатор, набор автоматических пипеток переменного объема, одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 мл, штативы для микропробирок, наконечников, одноразовые наконечники для пипеток переменного объемадо 200,0 и до 1000,0 мкл, ёмкость с дезинфицирующим раствором.

Примерный план занятия (2 часа)

1 Проведение тестирования студентов 

2 Объяснение преподавателя по теме занятия.

3 Демонстрация преподавателя по выделению ДНК из пробы, постановка амплификации, проведение горизонтального электрофореза, интерпретация полученных результатов.

4 Подведение итогов занятия

5 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1 В чём заключается принцип полимеразной цепной реакции?

2 Из каких этапов состоит ПЦР-анализ?

3 В чём заключается методика выделения ДНК?

4 В чём состоит методика амплификации?

5 Как интерпретируют результаты ПЦР?

 

 

Приложение 1