Тема 5 Использование куриных эмбрионов в вирусологии

Цель занятия: ознакомиться с анатомией куриного эмбриона на разных стадиях эмбрионального развития; овладеть методом овоскопирования; овладеть методами заражения эмбрионов вируссодержащим материалом.

Для культивирования вирусов с 30-х годов прошлого века начали использользовать эмбрионы курицы, которые в дальнейшем широко применялись в качестве живой системы в научной и практической вирусологии

Эта живая система имела целый ряд преимуществ не только перед естественно-восприимчивыми, но и лабораторными животными. К ним относятся следующие:

- скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от разных контаминантов, обеспечивая его герметичность и практическую стерильность;

- у куриных эмбрионов недостаточно развиты факторы иммунной защиты, в т.ч. механизм антителообразования, что делает эту живую систему чувствительной к более широкому спектру вирусов;

- эта живая система является достаточно простой биологической моделью при работе с ней, не требующей кормления, особого ухода и содержания.

Однако, необходимо учитывать тот факт, что куриный эмбрион может быть инфицирован вирусами, передающимися трансовариально от больной птицы. К ним относят вирусы лейкоза птиц, теносиновита или вирусного артериита птиц; синдрома снижения яйценоскости (ССЯ-76), ринотрахеита индеек и др.

Куриные эмбрионы  используют для индикации, изоляции, идентификации (в реакции нейтрализации) вирусов, вызывающих заболевания у птиц и некоторых млекопитающих; титрования вирусов; поддержания и накопления вирусов в условиях лаборатории.

Куриные эмбрионы должны отвечать определённым требованиям. Эмбрионы получают от здоровой не вакцинированной птицы из благополучных по инфекционным болезням птицефабрик с чистой и желательно не пигментированной скорлупой (удобнее проводить овоскопирование). Срок развития эмбриона должен соответствовать тропизму вируса определённого вида.

Стадии эмбрионального развития куриного эмбриона.

Куриный эмбрион – это оплодотворённое яйцо курицы со сроком инкубации 21 день. Его получают от кур на стадии бластулы или ранней гаструлы. При его инкубировании происходит дальнейшее развитие зародыша в искусственных условиях (рис. XIV).

Куриный эмбрион снаружи покрыт скорлупой, имеющей поры, через которые совершается газообмен (рис. 2). Под ней лежит подскорлупная (белковая) оболочка, которая у тупого конца эмбриона разделяется на два листка – внутренний, расположенный перпендикулярно центральной оси, и наружный, выстилающий тупой конец эмбриона. Между ними формируется камера (пуга), заполненная воздухом – воздушная камера. Скорлупа и подскорлупная оболочка защищают эмбрион от неблагоприятных факторов внешней среды.

На ранних сроках развития аллантоисная оболочка (сосудистая оболочка) срастается с хорионом (ворсинчатая оболочка) и образует единую хорионаллонтоисную оболочку (ХАО), которая расположена непосредственно под подскорлупной оболочкой. В ХАО находятся кровеносные сосуды, которые тесно прилегают к внутренней поверхности пористой скорлупы. Кровь насыщается кислородом и снабжает тело зародыша. ХАО ограничивает аллантоисную полость, в которой накапливаются продукты жизнедеятельности зародыша. Максимального развития аллантоисная полость и ХАО достигают на 9 – 11 день инкубации куриного эмбриона.

Сбоку (эксцентрично) от центральной оси эмбриона расположена амниотическая полость (амнион), выстланная амниотической оболочкой и заполненная жидкой средой, в которую погружено тело зародыша. Амнион является буферной средой развития зародыша и формируется на пятый день инкубации.

Зародыш пупочным канатиком связан с желточным мешком, который расположен с противоположной стороны от амниона. Это резервуар питательных веществ, который постепенно уменьшается в размере по мере развития зародыша. В области острого конца эмбриона расположен  белок.

1 – скорлупа 2 – подскорлупная оболочка 3 – хорионаллантоисная оболочка (ХАО) 4 – аллантоисная полость 5 – желточный мешок 6 – белок 7 – воздушная камера 8 – зародыш 9 – амниотическая полость (амнион)

 

Рис. 2 Схема структур куриного эмбриона в поперечном разрезе на 8-11-й день инкубации

Куриные эмбрионы используют для культивирования вирусов с 5-го по 12-й дни инкубации. Вирус инокулируют в определённые структуры эмбриона, исходя из его тропизма, в период их максимального развития, когда количество чувствительных клеток будет наибольшим (табл. 3).

Таблица 3

Сроки заражения куриных эмбрионов

Вид вируса	Структура куриного эмбриона	День инкубации
Вирусы: ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец, болезни Марека, лихорадки долины Рифт и др.	желточный мешок	5-7
Вирусы: гриппа, ньюкаслской болезни, чумы плотоядных, вирус парагриппа-3 и др.	амнион (зародыш)	8-10
Вирусы: гриппа, ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, ринопневмонии лошадей, везикулярного стоматита и др.	аллантоисная полость	9-11
Вирусы: оспы, болезни Марека, инфекционного ларинготрахеита, болезни Ауэски, катаральной лихорадки овец и др.	ХАО	9-11

Размножение вирусов возможно только в тех структурах эмбриона, которые имеют клеточное строение. К ним относятся зародыш, ХАО, оболочки желточного мешка и амниона. Вирус накапливается в оболочках и полостях эмбриона, стенками которых они являются.

Подготовка куриных эмбрионов к заражению. В лаборатории эмбрионы инкубируют в термостате при 37°С и влажности 60–70 %, закладывая в специальные штативы вертикально вверх воздушной ка­мерой.

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона методом овоскопирования. Для этого эмбрион просвечивают через источник яркого света в тёмном поле. К признакам жизнеспособности относят хорошо видимые кровенаполненные сосуды ХАО и подвижность зародыша, определяемую по перемещению его глаза (рис. XV). В процессе овоскопирования у жизнеспособного эмбриона на скорлупе простым карандашом обводят границу воздушной камеры, место расположения зародыша (проекция его глаза на скорлупу), безсосудистую зону на ХАО. Это служит ориентиром для введения вируссодержащего материала в его определённую структуру.

Методыэкспериментального заражения куриных эмбрионов. Заражение проводят в боксе с соблюдением правил работы с вируссодержащим материалом. Выбор метода инокуляции вируса определяется его тропизмом. Оптимальная доза заражения составляет 0,1-0,2 мл материала на эмбрион.

 Эмбрионы фиксируют в специальных штативах тупым концом вверх. Скорлупу обрабатывают раствором асептика (йодированный спирт) и фламбируют.

Заражение в аллантоисную полость можно проводить двумя способа­ми.

Способ 1. С помощью специального пробойника делают отверстие в скорлупе диаметром не более 1,0 мм со стороны зародыша или с противоположной стороны выше границы воздушной камеры на 5-6,0 мм. Иглу вводят параллельно центральной оси куриного эмбриона на глубину 10-12,0 мм (рис. 3). Инокулируют вируссодержащий материал в дозе 0,1-0,2 мл. Отвер­стие в скорлупе запечатывают парафином или лейкопластырем.

Рис. 3 Заражения куриного эмбриона в аллантоисную полость

Способ 2 (по Николау и др.). Делают два отверстия в скорлупе: первое – над воздушной камерой, второе – над участком безсосудистой зоны ХАО со стороны зародыша. Иглу вводят во второе отвер­стие перпендикулярно центральной оси куриного эмбриона на глубину не более 2-3,0 мм (рис. 4). Инокулируют вируссодержащий материал в дозе 0,1-0,2 мл. Отвер­стие в скорлупе запечатывают парафином или лейкопластырем.

 

 

2

1

Рис. 4 Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость (по Николау и др.): 1 – отверстие над воздушной камерой; 2 – отверстие над участком безсосудистой зоны ХАО.

Заражение на ХАО можно проводить двумя способа­ми.

Способ 1 (через естественную воздушную камеру). В скорлупе над центром воз­душной камеры вырезают часть скорлупы диаметром не более 15-20,0 мм. Через образовавшееся отверстие с помощью пинцета надрывают подскорлупную оболочку  и на обнажившийся участок ХАО наносят вируссодержащий материал в дозе 0,1-0,2 мл. После этого отверстие в скорлупе запечатывают лейкопластырем.

Способ 2 (через искусственную воздушную камеру). В скорлупе над центром воз­душной камеры делают первое отверстие диаметром не более 1,0 мм. Затем эмбрион переворачивают в горизонтальное положение зародышем вверх. В скорлупе над зародышем делают второе отверстие диаметром 3-5,0 мм. Скользящим движением, не повреждая ХАО, надрывают подскорлупную оболочку (через образовавшийся дефект должен проходить воздух). Резиновую грушу прикладывают к первому отверстию и отсасывают воздух из естественной воздушной камеры (рис. 5а). В результате чего, через второе отверстие воздух поступает в эмбрион и скапливается между подскорлупной оболочкой и ХАО. Образуется т.н. искусственная воздушную камеру, дном которой является прогнувшаяся вовнутрь ХАО (рис. 5б). Через образованное отверстие вводят иглу на глубину 5-10,0 мм под углом 20º. Инокулируют вируссодержащий материал в дозе 0,1-0,2 мл. Второе отвер­стие в скорлупе запечатывают лейкопластырем. Первое отверстие запечатывать не обязательно, т.к. внутренний листок подскорлупной оболочки не нарушается и продолжает выполнять роль барьера.

Рис. 5 Заражение куриного эмбриона на ХАО

Заражение в желточный мешок (по Николау). В скорлупе над центром воз­душной камеры делают отверстие диаметром не более 1,0 мм. Иглу вводят на глубину 35-40,0 мм под углом 45º к центральной оси эмбриона (рис. 6). Инокулируют вируссодержащий материал в дозе 0,1-0,2 мл. Отвер­стие в скорлупе запечатывают парафином или лейкопластырем.

Иногда аналогичный способ заражения проводят на эмбрионе, расположенном в штативе горизонатльно. При этом зародыш находится внизу, а желточный мешок – над ним.

 

Рис. 6 Заражение куриного эмбриона в желточный мешок

Заражение в амниотическую полость ( открытый способ). В скорлупе над воздушной камерой вырезают отверстие диаметром 15-25,0 мм. Через него пинцетом снимают участок подскорлупной оболочки, продавливают ХАО по направлению к зародушу. Когда пинцет достигнет тела зародыша, бранши пинцета размыкают, захватывают амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к отверстию в скорлупе. Удерживая одной рукой пинцет с фиксированными в нём оболочками, другой рукой  инокулируют вируссодержащий материал в дозе 0,1-0,2 мл в амниотическую полость (рис. 7). Отвер­стие в скорлупе запечатывают лейкопластырем.

Рис. 7 Заражение куриного эмбриона в амниотическую полость

Иногда заражение в амнион проводят закрытым способом в затемнённом боксе. Для этого эмбрион помещают в горизонтальном положении над источником света зародышем вверх. Через ответстие в центре скорлупы над воздушной камерой водят иглу с затуплённым концом по направлению к зародышу. Доказательством того, что игла проникла в амнион является движение тела зародыша.

Заражение в тело зародыша можно проводить двумя способа­ми.

Способ 1. Заражают так же, как в амнион закрытым способом с той лишь разницей, что вирус вводят острой иглой. На овоскопе доказательством проникновения иглы в зародыш считают «подчинение» зародыша движениям иглы.

Способ 2. Заражают также, как в амнион открытым способом. Вируссодержащий материал вводят в определённые участки тела или в головной могз.

После заражения на скорлупе эмбриона простым карандашом отмечают дату и другие сведения.

Описанные выше методы экспериментального заражения куриных эмбрионов могут иметь и другие варианты исполнения.

Однако нужно учитывать, что при заражении возможен некоторый  процент неспецифической гибели эмбриона. Поэтому заражают одним материалом единовременно до 10 шт. эмбрионов.

Обязательно оставляют несколько эмбрионов не зараженыых – это контроль.

Заражённые и контрольные эмбрионы помещают в термостат (инкубатор) для дальнейшей инкубации при 37 °С и относительной влажности 60-70 %.

Материальное обеспечение: куриные эмбрионы (9-11 дневные), овоскоп, вируссодержащий материал (вакцинные штаммы вирусов), штативы для куриных эмбрионов, лоток эмалированный, стерилизатор со стерильным инструментарием (шприц, пинцет анатомический, пробойник), газовая горелка, вата, 70 ° этиловый спирт, стерильные ватные тампоны, парафиновый карандаш, лейкопластырь.

Примерный план занятия (2 часа)

1 Проведение тестирования студентов 

2 Объяснение преподавателя по теме занятия.

3 Демонстрация: а) овоскопирования куриных эмбрионов; б) методов заражения куриных эмбрионов.

4 Самостоятельная работа студентов: а) овоскопирование куриных эмбрионов; б) заражение куриных эмбрионов.

4 Подведение итогов занятия

5 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1 Из каких структур состоит куриный эмбрион?

2 Какие функции выполняют определённые структуры куриного эмбриона?

3 От чего зависит выбор метода заражения куриного эмбриона?

4 Что такое овоскопирование куриного эмбриона?

5 Какие методами выполняют заражение куриных эмбрионов?