Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori

Сегодня не подвергается сомнению патологическая роль в этиопатогенезе большинства гастродуоденальных заболеваний «спиралевидных бактерий» (Helicobacter pylori), выделенных и описанных в 1983 году J.R.Warren и B.J.Marshall (рис. 5. 91). На сегодняшний день получены убедительные доказательства участия H.pylori в повреждении слизистой оболочки желудка при гастрите, язвенной болезни обеих локализаций, дуодените, неязвенной диспепсии. Кроме того, получены доказательства о значении H.pylori как одного из факторов риска развития рака желудка и неходжкинских лимфом гастродуоденальной зоны.

Для диагностики инфекции H.pylori предложено множество различных методов, причем большинство из них постоянно модифицируется. Следует отметить, что выбор метода исследования на инфицированность H.pylori, или их комплекса, зависит от конкретных задач врача или исследователя. Наиболее рациональной представляется классификация методов, указанная выше (см. табл. 5.5).

Бактериологический метод исследования инфекции Н. pylori, являясь прямым и инвазивным методом диагностики хеликобактериоза специфичен на уровне 95-100%, при чувствительности - 80-90%. Для культивирования Н. pylori применяются среды, которые позволяют транспортировать биопсийный материал в течение суток (среда Стюарта, Кэри-Блер, Био Мерьо). Далее испытуемый образец ткани высевается на искусственные питательные среды: а) неселективные (агар Колумбия) и б) селективные, содержащие ванкомицин, триметоприм, полимиксин) для подавления сопутствующей микрофлоры. После высевания ожидаемая культура подвергается инкубации в течение 3-5 суток. Инкубация проходит в микроаэрофильных условиях при температуре 37˚С и влажности 100%..

Оценка проводится полуколичественным методом, в зависимости от числа выросших изолированных колоний: до 10 колоний (+), 10-20 колоний (++), 20-50 колоний (+++), свыше 50 колоний (++++). Кроме того, выделенные культуры идентифицируются как Н. pylori по морфологическим (при окраске по Граму) и биохимическим критериям (определение уреазной, каталазной, оксидазной активности, способности бактерии не ферментировать глюкозу, не продуцировать нитраты и не образовывать индол).

Очень важной особенностью бактериологического метода определения инфицирования Н. pylori является возможность с его помощью определить устойчивость к антибактериальным препаратам, проводить клинические испытания новых лекарственных антибактериальных препаратов направленных на эрадикацию Н. pylori.

 Морфологические методы. “Золотым стандартом” диагностики НР-инфекции является гистологический метод. Специфичность данного прямого, инвазивного метода исследования оценивается на уровне 97%, а чувствительность - 80-90%. Для проведения гистологического исследования на Н. pylori биопсийный материал окрашивают акридиновым оранжевым, по Гимзе, Граму, толуидиновым синим, серебрением по Вартину-Старри и др. Наиболее простым и доступным методом выявления Н. pylori является окраска по Гимзе без дифференцировки. Микроорганизмы при этом окрашиваются в темно-синий цвет и хорошо визуализируются как на поверхности эпителия, так и в глубине ямок.

При оценке гистологических препаратов обычно выделяют З степени обсеменения слизистой оболочки: а) слабая степень (+) - до 20 микробных тел в поле зрения при увеличении Х 630; б) средняя степень (++) - от 20 до 50 микробных тел в поле зрения; в) высокая степень (+++) - более 50 микробных тел в поле зрения.

Несомненным преимуществом данного метода является не только возможность верификации микробного обсеменения слизистой, но и оценка состояния последней (воспаление, атрофия, метаплазия и др.).

В последнее время разработан новый наиболее чувствительный иммуногистохимический метод обнаружения Н. pylori с применением моноклональных антител и комплекса авидин-биотин-пероксидазы.

К перспективным высокочувствительным и специфичным методам выявления Н. pylori относится и метод гибридизации дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в обычных парафиновых срезах. Метод позволяет идентифицировать различные штаммы Н. pylori, помогая выяснять природу рецидивов после успешной эрадикации Н. pylori.

 Цитологический метод определения Н. pylori в мазках-отпечатках также относится к прямым, инвазивным методам. Преимуществом данного метода является его меньшая трудоемкость по сравнению с гистологическим исследованием, что значительно сокращает время получения результатов. Существует несколько разновидностей данного метода: а) crush cytology (раздавливание биоптата); б) imргint или touch суto1ogy (прикосновение и отпечаток люминальной поверхности биоптата к предметному стеклу); в) brush cytology (получение пристеночной слизи с помощью специальной щеточки, входящей в комплект современных эндоскопов). Биопсия обычно берется из участков с наиболее выраженными визуальными отклонениями от нормы (гиперемия, отек), но не из дна язв или эрозий.

Высушенные мазки окрашиваются по Граму, Папенгейму, красителем Романовского-Гимзы или после фиксации метанолом-азур-эозиновой смесью. Применяемые паноптические методы окраски позволяют выявить наличие Н. pylori и ориентировочно оценить количество микроорганизмов. Как правило, Н. pylori располагаются в слизи, имеют спиралевидную, изогнутую форму, могут быть и S-образными, кокковидными.

Кроме обнаружения Н. pylori в мазках-отпечатках могут выявляться ассоциированные с Н. pylori явления клеточной инфильтрации, характеризующейся наличием лимфоцитов, плазматических клеток, нейтрофилов и эозинофилов. По преобладанию тех или иных клеточных элементов можно косвенно судить об активности и выраженности воспаления. Цитологическое исследование позволяет также выявлять морфологические особенности строения ядер и цитоплазмы клеток слизистой оболочки желудка и ДПК, наличие пролиферативньих процессов, злокачественного образования, метаплазии, дисплазии и степень их выраженности. Однако этот метод не дает информации о структуре исследуемой слизистой.

Следует помнить, что Н. pylori колонизирует только эпителий желудочного типа и в участках кишечной метаплазии его не обнаруживается, одновременно в ДПК забор биопсии в участках желудочной метаплазии может дать положительный результат. Отсутствует Н. pylori  и в краях язвенных дефектов желудка и ДПК. Особенно сложно выявить Н. pylori после лечения антисекреторными препаратами (блокаторами протонной помпы), препаратами висмута, антибиотиками. При длительном применении блокаторов протонной помпы Н. pylori могут переселяться в зону желудочного кислотообразования, проксимально. Для исключения ложноотрицательных результатов необходима множественная биопсия (5-7 биоптатов).

Биохимические методы. Н. pylori обладает уникальной способностью продуцировать уреазу, разлагающую мочевину до углекислого газа и ионов аммония. Биохимический метод определения уреазной активности включает в себя быстрый уреазный и дыхательный тесты. Данные методы исследования инвазивные но не прямые, а их относительная специфичность основана на высоком уровне продукции уреазы, свойственной Н. pylori, в отличие от других присутствующих в желудке и ДПК микроорганизмов продуцирующих уреазу.

Инфицированность слизистой оболочки Н. pylori оценивается полуколичественным методом в зависимости от появления малинового окрашивания (изменение рН в присутствии индикатора). Определение проводится в течение первого часа, последующих 2 часов и к концу первых суток. Если окрашивание наступает в более поздние сроки - результат считается отрицательным (рис. 5.92). В настоящее время имеются уреазные тесты промышленного производства (де-Нол тест, СLO тест, РуlогiТеk, НUТ-тест и др.). Чувствительность этих методов на уровне 64-99%, а специфичность - 75-95%.

Достоинствами уреазных тестов является простота их выполнения, относительная дешевизна и быстрота. Однако метод не лишен и недостатков, среди них: неустойчивость растворов при хранении, необходимость в ряде случаев термостатирования, длительность реакции до суток, возможность как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов, особенно при низкой степени обсемененности НР и использования одного фрагмента ткани слизистой оболочки.

Кроме перечисленных тестов существует и количественный спектрофотометрический метод определения уреазной активности в биоптатах, который позволяет количественно определять уреазную активность Н. pylori, что особенно важно при незначительной степени обсеменения слизистой Н. pylori, при которых вышеописанные тесты могут давать сбои.

На определении уреазной активности Н. pylori основаны также неинвазивные, косвенные радионуклидньие методы диагностики НР- инфекции - неинвазивные и косвенные. К ним относятся уреазньие дыхательные тесты с мочевиной, меченной изотопами углерода ¹³С или ¹⁴С. ¹⁴С является радиоактивным изотопом и его применение имеет ряд ограничений и соответствующих гигиенических и технических условий. В отличие от ¹⁴С ¹³С не радиоактивен, поэтому методика с его использованием наиболее распространена. Меченая ¹³С мочевина дается пациенту в составе пробного завтрака. Уреаза Н. pylori разлагает мочевину до углекислого газа, сохраняющего меченый углерод. Приращение в выдыхаемом воздухе ¹³СО₂ фиксируется с помощью масс-спектрометра. В норме содержание стабильного изотопа не превышает 1% от общего количества СО₂ в выдыхаемом воздухе. При инфицированности Н. pylori регистрируется 4 ее степени: легкая - менее 3,5%, средняя - 3,5-6,4%, тяжелая - 6,5-9,4% и крайне тяжелая степень, при количестве СО₂ - более 9,5%.

Этот дыхательный тест с успехом может быть использован для обследования детей, при эпидемиологических исследованиях больших контингентов населения, а также у больных, которым противопоказано проведение эндоскопической процедуры.

Дыхательные тесты не подвержены ошибкам, связанным с особенностями методов, использующих гастробиоптаты, так как дают представление об уреазной активности со всей поверхности слизистой, позволяют косвенно оценивать степень ее колонизации и являются диагностически значимыми для контроля за эрадикацией Н. pylori. Ограничивает широкое внедрение данной методики только высокая стоимость масс-спектрометра. Однако, в последнее время, появились сообщения о появлении в лабораторном техничском арсенале более дешевых приборов для регистрации данных дыхательных тестов, на основе применения лазерной техники, что значительно удешевит методику исследования.

Маастрихтским соглашением – 3, определено, что основу диагностики Н. pylori составляют Неинвазивные методы и, в частности, ¹³С дыхательный тест, который имеет преимущества перед тестом по антигену в кале (см. ниже).

 Выявление Н. pylori в гастробиоптатах можно проводить и иммуногистохимически с использованием моноклональных антител со 100% успехом.

В нашей стране получил распространение аэротест на Н. pylori, основанный на регистрации аммиака в выдыхаемом воздухе. Аммиак образуется в организме человека в результате жизнедеятельности Н. pylori и регистрируется с помощью газоанализатора. Е.А. Корниенко и В.Е. Милейко предложили новый способ диагностики инфекции Н. pylori, основанный на оценке прироста уровня аммиака в выдыхаемом воздухе до и после приема пациентом карбамида нормального изотопного состава. Модификация аэротеста получила название ХЕЛИК-тест. Его чувствительность составляет 95%, а специфичность - 96%.

Среди инвазивных методов диагностики Н. pylori у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки высокой чувствительностью и специфичностью обладают: гистологический, бактериологический методы, а уреазный тест характеризуется умеренной чувствительностью и специфичностью.

Иммунологические методы. Известно, что через 3-4 недели после инфицирования Н. pylori наблюдается специфический гуморальный иммунный ответ против его антигенов. Образующиеся антитела могут быть определены в сыворотке крови больного различными серологическими методами (реакции агглютинации, непрямой гемагглютинации, преципитации и др.). Самым распространенным методом является иммуноферментный анализ (ИФА) - ELISA (enzime-linked immunosorbent assay). Данный метод является косвенным и неинвазивным. Чувствительность указанного метода находится в пределах 93-100%, а специфичность составляет 93-95%. Этим тестом выявляют антитела классов IgM, IgG, IgA, чаще IgG, в сыворотке крови, ко многим антигенам Н. pylori. Также этим методом можно определять секреторные IgA и IgM в слюне и содержимом желудка.

С помощью ИФА можно косвенно оценить патогенность штаммов Н. pylori (в частности определить СаgA-статус) и осуществлять многие годы наблюдение за больными после курса лечения. Необходимо помнить, что в ранние сроки инфицирования (в течение первого месяца), результат ИФА отрицателен. Кроме того, тест остается положительным еще как минимум 4-6 недель после успешной эрадикации Н. pylori, а оценку динамики уровня антител необходимо проводить не ранее 6 месяцев после лечения.

Одной из последних разработок было создание экспресс-тестов, позволяющих провести качественную оценку поливалентного гуморального иммунного ответа на комплекс антигенов Н. pylori. Данные тесты основаны на латекс агглютинации или твердофазном ИФА. В качестве источника исследуемого материала используется капиллярная кровь из пальца, а результат читается через несколько минут.

Среди наиболее специфичных и чувствительных, выделяются тесты, основанные на применении иммунного блоттинга. С их помощью могут быть выявлены антитела классов IgM, IgG, IgA к различным антигенам НP, в том числе, к тем из них, антитела к которым не выявляются с помощью иных методик.

В 2000 году была разработана тест-система для определения концентрации антигена Н. pylori в кале с помощью количественного ИФА. Результат считается положительным при появлении яркого желтого окрашивания смеси исследуемой пробы. Интенсивность цвета оценивается спектрофотометрически.

Одной из последних разработок является тест URINELISA Н.руlогi Аntibody, основанный на твердофазном ИФА, с помощью которого можно определять антитела к антигенам Н. pylori в моче. Последние рекомендации (Маастрихт – 3) для скрининга Н. pylori отдают преимущество именно тестам с определением антихеликобактерных антител в слюне и моче. 

Молекулярные методы. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), предложенный в 1983 году, за открытие которого в 1993 году американцу Кагу В. Мullis была присуждена Нобелевская премия по химии, в настоящее время активно внедряется в практику, в частности для верификации инфицирования Н. pylori. Чувствительность и специфичность ПЦР на уровне 95-100%. Метод идентификации Н. pylori с помощью ПЦР основан на выявлении фрагмента того или иного гена микроорганизма (саgА, ureC, vасА и др.). Уникальность данного молекулярно- генетического метода диагностики не только в высокой специфичности, но и в том, что материалом для него является любой биологический материал (биоптаты слизистой оболочки желудка и ДПК, желудочный сок, смывы из полости рта, зубной налет, копрофильтраты и т.п.). ПЦР позволяет выявлять, дифференцировать штаммы бактерий между собой по различным признакам, в том числе по факторам патогенности, определять резистентность к антибиотикам.

Маастрихтский консенсус-3 определил как наиболее оптимальный для настоящего времени метод диагностики Н. pylori – дыхательный тест с мочевиной, меченной С¹³. В его отсутствие, для диагностики инфекции Н. pylori у больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки возможно применять сочетание гистологического метода и уреазного теста, с помощью которых достаточно информативно можно выявить микроорганизм, а также оценить степень обсемененности и морфологические изменения слизистой оболочки.