Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь FAQ Написать работу КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Твердофазные виды ИФА. Подбор условий методом «шахматной доски»Содержание книги
Поиск на нашем сайте
Гетерогенные методы иммуноферментного анализа. Гетерогенный иммуноферментный анализ объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения. Если на первой стадии антиген или антитело используют в иммобилизованном состоянии и формирование специфического иммунокомплекса проходит на твердой фазе, то метод относится к твердофазным (англ. solid phase assay). Если же на первой стадии анализа образование специфических иммунных комплексов происходит в растворе, а лишь затем для целей разделения используют твердую фазу с иммобилизованным реагентом, то такие методы целесообразно классифицировать как гомогенно-гетерогенные. Многообразие методов гетерогенного иммуноферментного анализа, относящихся к типам 1 и 2, обусловлено возможностью введения ферментной метки, как в молекулу антигена, так и молекулу антитела. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из реагентов – антитело или антиген, использован в иммобилизованном виде для разделения иммунохимических комплексов от не связавшихся компонентов. В качестве примера гетерогенного неконкурентного метода проведения иммуноферментного анализа приведем одну из самых распространенных схем иммуноферментного анализа белков (поливалентных антигенов), основанную на использовании пары антител различной антигенной специфичности, одно из которых иммобилизовано на поверхности твердого носителя, а второе конъюгировано с ферментной меткой (например, пероксидазой хрена). Анализ проводят следующим образом. В лунки полистирольного планшета с сорбированными антителами вносят анализируемый образец, инкубируют в течение 1 часа, при этом анализируемый антиген вступает в реакцию с антителами и образует иммунокомплекс на поверхности лунок. Планшет отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых антител, что послужило поводом для широкого распространения в литературе названия «сэндвич»-метод (англ. sandwich). Схема может быть использована для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две расположенные далеко друг от друга антигенные детерминанты, а для определения большого числа моновалентных антигенов (например, низкомолекулярные гормоны, лекарственные соединения, пестициды) метод неприемлем. Конкурентный твердофазный анализ низкомолекулярных антигенов может быть реализован по следующей схеме. К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена. Конкурентные твердофазные методы обладают меньшей чувствительностью по сравнению с неконкурентными. Важную роль в проведении конкурентного ИФА играет правильный подбор концентраций твердофазного антигена и жидкофазного антитела, что обеспечивает эффективную конкуренцию свободного антигена за связывание с антителом. Оптимальными считаются концентрации, при которых взаимодействие твердофазного антигена с антителом дает значение оптической плотности в ИФА, приближенное к единице. Поэтому на первом этапе проводился подбор оптимальных концентраций методом «шахматной доски» в перекрестном твердофазном ИФА.
|
||||
Последнее изменение этой страницы: 2017-02-07; просмотров: 435; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.14.135.82 (0.01 с.) |