Вопрос. Гибридомная технология.

Гибридомы- продуктобъединения свойств миеломных и обычных В-клеток путем их слияния.

Первым этапом является иммунизация животного (например, белой мыши) тем антигеном, к которому необходимо получить моноклональные антитела. После развития иммунного ответа (что контролируется по появлению в сыворотке крови животного антител к выбранному антигену) из селезенки животного отбирают лимфоциты, смешивают с суспензией ГАТ-чувствительных миеломных клеток мыши, добавляют вещество, способствующее слиянию клеток (например, полиэтиленгликоль) и выдерживают необходимое для слияния время. Затем получившуюся смесь высевают на ГАТ-среду. Поскольку слияние происходит неконтролируемо, в смеси могут содержаться: 1) не слившиеся В-лимфоциты из селезенки, 2) слившиеся друг с другом В-лимфоциты из селезенки, 3) не слившиеся миеломные ГАТ-чувствительные В-лимфоциты, 4) слившиеся друг с другом миеломные ГАТ-чувствительные В-лимфоциты, 5) гибридомы, являющиеся результатом слияния В-лимфоцитов из селезенки и миеломных ГАТ-чувствительных В-лимфоцитов. К размножению на ГАТ-среде оказываются способными только представители 5-й группы из присутствующих в смеси клеток, так как: первые две группы не дадут клонов из-за неспособности обычных, не раковых, клеток длительно размножаться in vitro, две вторые – в силу их чувствительности к ГАТ-среде. Зато в 5-й группе могут оказаться такие объединенные клетки, потомки которых унаследуют от миеломной клетки способность постоянно делиться, а от нормального, не ракового, В-лимфоцита – нечувствительность к ГАТ-среде. Сформировавшиеся клоны проверяют на способность продуцировать антитела и отбирают те из них, которые дают антитела к использованному для иммунизации животного антигену. Часть клеток из каждого такого клона консервируют путем замораживания при температуре жидкого азота, а сам клон подвергают расчистке. Суть расчистки заключается в разделении клона на изолированные клетки, получении их потомства и анализе этого потомства на однородность и продукцию нужных антител. При необходимости проводят несколько последовательных расчисток получаемых дочерних клонов, причем на каждом этапе расчистки часть клеток каждого клона также консервируют, чтобы в случаях гибели клона была возможность не повторять процедуру с начала, а продолжить ее с конкретного этапа. Полученные стабильные, не дающие расщепления клоны являются источниками гибридом, пригодных для получения абсолютно однородных по специфичности и изотипу антител, которые и называют моноклональными. Наработку нужного количества антител осуществляют либо побуждая гибридомные клетки к продукции антител в культуре, либо вводя суспензию таких гибридом в организм специально подготовлен-ных лабораторных животных.

Если выбранный для иммунизации антиген был поливалентным, возможно получить столько клонов гибридом, сколько у данного антигена имеется антигенных детерминант. А это значит, что с использованием таких антител можно отличать и отделять друг от друга очень близкие по структуре молекулы, что невозможно при применении поликлональных антител. Преимущества моноклональных антител подтверждены уже более чем тридцатилетним опытом их применения в различных областях биологии и медицины. Благодаря использованию таких иммуноглобулинов удалось обнаружить и получить в пригодном для исследования количестве и виде множество не выявляемых другими методами веществ. В настоящее время моноклональные антитела все шире используются в масштабном промышленном производстве высокочистых препаратов для научных и медицинских целей. Осуществляемая с их помощью аффинная хроматография позволяет достигать максимально высокой степени гомогенности производимых веществ. На основе моноклональных антител разработаны специальные диагностические наборы, позволяющие идентифицировать возбудителей инфекционных заболеваний и антигены, появляющиеся в организме при различных патологиях неинфекционной природы.

 

11. инженерия антител, целью которого является получение на основе генов

иммуноглобулинов несуществующих в природе конструкций с заданными свойствами. Методы генетической инженерии дают возможность эффективно менять как макро- так и микроструктуру получаемых искусственных антител. Примером первого является изменение изотипа антитела путем использования генов, кодирующих соответствующую Fс-область. Примером второго - точечные замены аминокислот путем направленного мутагенеза, приводящие к изменению эффекторных функций, если замена произведена в Fс-области, или к изменению сродства (как повышению, так и понижению) к антигену, когда меняются остатки в CDR-участках вариабельных доменов.

Рекомбинантные антитела могут играть важную роль в лечении инфекционных и

аутоиммунных заболеваний. По литературным данным в настоящее время такие препараты на стадии прохождения клинических испытаний находятся на втором месте после вакцин. В основном производятся химерные (мышь–человек) и гуманизированные антитела,однако использование таких антител может приводить к возникновению нежелательного иммунного ответа на «мышиную» часть молекулы. Более перспективным, с точки зрения терапии, представляется получение полностью человеческих полноразмерных антител.

Одним из подходов к созданию таких препаратов может быть конструирование

полноразмерных человеческих антител на основе мини-антител человека, полученных из

комбинаторных фаговых библиотек, в частности, библиотек одноцепочечных антител.

Получения а/т: 1)создание клонирования сегментов генов иммуноглобулинов,2)получение библиотеки (фаг и дрожжи),3)слияние белков,4)ферментация 5)определяются критерии антител.