Методы, применяемые в иммунодиагностике

Тесты первого порядка – для определения группы диагнозов. Тесты 2, 3 и т.д. порядков – для уточнения диагноза.

Двойная радиальная иммунодиффузия - полуколичественный метод, с помощью которого можно не только выявить антигены, но и оценить степень сходства между ними. Суть метода заключается в следующем:

- в лунки, вырезанные в агаре, вносят исследуемую смесь антигенов и антитела с известной специфичностью (обычно в центральную лунку вносят антитела, а в расположенные вокруг нее - антигены);

- антигены и антитела диффундируют по направлению друг к другу;

- в том месте, где произошло связывание антител и антигенов, образуются полосы преципитации. По взаимному расположению и форме полос преципитации можно оценить степень сходства между антигенами, находящимися в соседних лунках. В настоящее время этот метод применяется в диагностике аутоиммунных заболеваний для выявления аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам. Хотя по чувствительности метод двойной радиальной иммунодиффузии уступает многим количественным методам, технически он прост, не требует высокоочищенных антител, специфичен и может использоваться при проведении массовых исследований.

Простая радиальная иммунодиффузия позволяет количественно определить содержание антигена в исследуемой пробе. Суть метода заключается в следующем. В слое агара, содержащего антитела, вырезают лунки, в одни из которых вносят исследуемый антиген, в другие - стандартный. Антигены диффундируют из лунок в агар, образуя радиальные зоны преципитации. Диаметр зоны преципитации пропорционален концентрации антигена. Это простой и надежный метод количественной оценки иммуноглобулинов (включая подклассы IgG), компонентов комплемента (например, СЗ, С4, фактора В) и других белков сыворотки. Существуют готовые наборы, позволяющие определить антиген в низкой концентрации - не более 3 мкг/мл. Определяя содержание иммуноглобулинов, необходимо учитывать, что изменение их свойств может искажать результаты исследования. Так, если в сыворотке содержатся мономерные IgM (например, при макроглобулинемии Вальденстрема, атаксии-телеангиэктазии), уровень IgM будет искусственно завышен, поскольку мономерный IgM диффундирует быстрее, чем пентамерный. Присутствие ревматоидного фактора в исследуемой пробе, напротив, искусственно снижает уровень IgG, поскольку иммунные комплексы, состоящие из IgG и ревматоидного фактора, диффундируют медленнее, чем несвязанный IgG. Сыворотка многих больных с дефицитом IgA содержит антитела к белкам животного происхождения, например к козьим иммуноглобулинам, поэтому при использовании козьих антител для определения уровня IgA в этом случае получаются завышенные результаты.

Твердофазный иммуноферментный анализ применяют для количественной оценки антител и антигенов. По чувствительности он сопоставим с радиоиммунным анализом, но более прост, дешев и не требует применения радиоактивных изотопов. Многие лаборатории используют твердофазпый иммуноферментный анализ в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG).

Иммуноблоттинг - качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом:

- смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану;

- мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем - с мечеными антителами к иммуноглобулинам.

Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного иммуноферментного анализа при диагностике ВИЧ- инфекции.

Непрямая иммунофлюоресценция - метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. В качестве источника антигена обычно используют срезы тканей или культуры клеток. Субстрат, перенесенный на предметное стекло, инкубируют в присутствии исследуемой пробы, например сыворотки, а затем - в присутствии меченых флюорохромом антител к иммуноглобулинам. Связанные с субстратом антитела выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа. Этот метод обычно применяется для выявления антинуклеарных антител и антител к некоторым вирусам. Хотя метод не является количественным, он достаточно чувствителен и прост.

Гемагглютинация применяется для выявления антител к тиреоглобулину и микросомальным антителам, латекс-агглютинация - для выявления ревматоидного фактора и некоторых других антител. Эти методы просты и позволяют количественно определить антиген, однако менее чувствительны, чем радиоимунный и твердофазный иммуноферментный анализы.

Определение общего уровня IgE обычно проводят с помощью радиоиммунного анализа, поскольку низкое содержание этого иммуноглобулина не позволяет использовать те методы, которые применяются для определения IgG, IgA и IgM.

Количественную оценку IgE проводят таким образом:

- исследованную пробу добавляют к сорбированным на твердой подложке антителам против IgE;

- после отмывания от несвязанного IgE добавляют меченные изотопом антитела к IgE;

- после отмывания от несвязанных антител по уровню радиоактивности определяют количество IgE в исследуемой пробе.

Определение специфических IgE обычно проводят с помощью кожных проб. Определение специальных IgE с помощью радиоаллергосорбенного теста показано при высоком риске анафилактических реакций, пораженной кожи и проведения лечения, влияющего на результаты кожных проб. Суть метода заключается в следующем:

- к аллергену, сорбированному на твердой подложке, добавляют исследованную сыворотку;

- после отмывания не связавшихся IgE добавляют меченые тела к IgE;

- по уровню радиоактивности определяют содержание специфических IgE в исследованной пробе.

Применяется модификация метода с использованием меченых ферментов антител к IgE.

Методы, основанные на реакции высвобождения гистамина тучными клетками. Суть методов заключается в следующем:

- к тучным клеткам, покрытым специфическим IgE, добавляют антиген;

- связывание антигена с IgE вызывает дегрануляцию тучных клеток и высвобождение гистамина;

- определяют содержание гистамина в растворе.

Одной из разновидностей реакций гемагглютинации является реакция Кумбса, применяемая для выявления неполных антител. Как уже упоминалось ранее, такие антитела закрепляются на поверхности эритроцитов естественным образом, поэтому если смешать суспензию эритроцитов с антителами, комплементарными изотипическим антигенным детерминантам иммуноглобулинов определенного класса (антииммуноглобулинами), будет происходить их агрегирование. Такой вариант реакции Кумбса называется прямым и применяется для выявления уже сорбированных неполных антител. Для выявления неполных антител в плазме крови смешивают взятую от пациента сыворотку и суспензию эритроцитов другого организма, выдерживают необходимое для адсорбции неполных антител время и добавляют антииммуноглобулины. Такой тест называется непрямой реакцией Кумбса. Реакции выявления неполных антител проводят при ряде неинфекционных (гемолитическая анемия, желтуха новорожденных и др.) заболеваний и некоторых инфекционных (бруцеллезе, туляремии и др.) болезнях.

Примером реакции, в которой используются комплемент и эритроциты, является реакция связывания комплемента (сокращенно РСК). Наибольшую известность получило применение этой реакции в диагностике сифилиса, поскольку выявлять образующиеся в малых количествах в организме болеющих антитела против возбудителя этой болезни методами преципитации или агглютинации не удавалось. В настоящее время существует еще несколько серологических методов диагностики сифилиса, но РСК не утратила своего значения до сих пор. Для постановки этой реакции принято готовить две системы. Система I представляет смесь диагностикума, содержащего антигены Treponema pallidum (возбудителя сифилиса), прогретой до 57˚С в течение 30 мин исследуемой сыворотки (прогревание необходимо для инактивации комплемента человека в сыворотке) и раствор комплемента (чаще всего морской свинки) в строго определенном количестве (так называемый оттитрованный комплемент). Параллельно готовят систему II (гемолитическую систему), которая содержит 3 % взвесь отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана и сыворотку кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Все компоненты обоих систем, кроме эритроцитов и анализируемой сыворотки, производятся промышленно и поставляются в лаборатории в лиофилизированном состоянии. Для проверки качества используемых растворов и условий проведения реакции каждый раз готовят контроли: 1) диагностикума – диагностикум + комплемент + физиологический раствор (вместо сыворотки), 2) комплемента – раствор комплемента + двойной объем физиологического раствора, 3) исследуемой сыворотки – сыворотка + комплемент + физиологический раствор (вместо диагностикума), 4) заведомо положительный контроль – стандартная иммунная сыворотка против антигенов Treponema pallidum + диагностикум + комплемент, 5) заведомо отрицательный – сыворотка здорового человека + диагностикум + комплемент. После инкубирования системы I, системы II и всех контролей в течение 45 мин при 37˚С во все пробирки доливают двойной объем системы II и продолжают инкубирование при этой же температуре до полного гемолиза в контрольных пробирках 1–4 (обычно 30–40 мин). Если в опытной пробирке имеет место гемолиз – раствор становится красным и прозрачным (так называемая «лаковая кровь»), результат реакции считается отрицательным. Если эритроциты не лизируются, а оседают на дно (раствор становится прозрачным, но бесцветным) – положительным. Суть такого прочтения результатов заключается в следующем. При наличии в исследуемой сыворотке антител к антигенам диагностикума активация комплемента происходит еще в первой системе, и он, будучи добавлен в ограниченном количестве, израсходуется. При отсутствии таких антител антиген сохраняется в исходном количестве и фактически переходит в систему II, где активируется на поверхности покрытых антителами кролика эритроцитов барана, что и приводит к их гемолизу и выходу гемоглобина в раствор.