Метод иммуноферментных пятен (ELISPOT).

В 1983 году адаптировали технологию твердофазного ИФА для определения лимфоидных клеток, секретирующих антитела или антигены (например, цитокины), in vitro. Метод получил название ELISPOT (метод иммуноферментных зон или пятен). Основной принцип метода:

1. На поверхности полистироловой лунки (используют 24-х луночные панели для культивирования клеток) сорбируют антигены или антитела, которые служат «ловушечными» реагентами.

2. Добавляют исследуемые лимфоидные клетки, культивируют несколько часов при 37°С, давая им возможность занять определенное место и выполнить секреторную функцию. Антитела или антигены, секретируемые такими клетками, улавливаются адсорбированными на твердой фазе реагентами.

3. Клетки удаляют, используя для этого отмывающий раствор с детергентом, лизирующим клетки.

4. Участки накопления секреторных продуктов проявляют, добавляя связанные с ферментом антитела (антиглобулиновый реагент).

5. Добавляют смесь субстрата с агарозой (используемые субстраты должны растворяться в агарозе и образовывать нерастворимые продукты реакции), на поверхности твердой фазы образуются коричневые или голубые пятна (в зависимости от используемых ферментов и субстратов), выявляя участки, где располагались клетки.

• Образовавшиеся пятна подсчитывают под микроскопом, это и будет количество секретирующих клеток.

В качестве твердой фазы может быть использована нитроцеллюлозная мембрана В этом случае есть ряд преимуществ: из-за высокой адсорбционной способности НЦМ требуется значительно меньшее количество антигена, используемого в качестве «ловушечного» реагента, кроме того, отпадает необходимость во включении агарозы в субстрат.

При параллельном определении количества секретирующих клеток и общего количества секретируемого антигена или антитела в лунке, что возможно при использовании другого субстрата, можно выявить количество секретируемого вещества единичной клеткой.

Данный метод нашел широкое применение для оценки количества клеток, секретирующих антиген, улавливаемый адсорбированными антителами, используется для определения количества клеток, секретирующих цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИФН-у, ФНО-а).

Метод поляризационного флуороиммуноанализа (ПФИА), который является

одним из современных и перспективных видов иммуноанализа. Главные

его достоинства - экспрессность, высокая чувствительность и

специфичность, малое количество исследуемого образца, отсутствие

стадии пробоподготовки, полная автоматизация качественного и

количественного анализа. За рубежом ПФИА хорошо известен и широко

используется как для мониторинга лекарственных средств, так и в

контроле за употреблением наркотических и одурманивающих веществ.

В качестве объектов для исследования используются моча и сыворотка

крови пациентов.

ПФИА является гомогенным конкурентным методом иммуноанализа,

основанным на конкуренции меченого флуоресцентным красителем

антигена (трейсера) с немеченым антигеном (в исследуемом образце)

за ограниченное количество центров связывания антител.

Концентрация анализируемого вещества в пробе определяется степенью

связывания трейсера с антителом. Образование такого иммунного

комплекса устанавливается путем измерения поляризации

флуоресценции.

Метод включает следующие стадии:

- калибровка;

- анализ образцов мочи.

35. иммуногистология. Делают на стекле, делают срезы, кровяные мазки. Для подготовки важны—срез—фиксация на стекле(парафиновые срезы, смолы, способ прилипания клеток крови на пластик)—убивают эндогенные ферменты—забивка—1 слой антител—может 2-ой—весь препарат фиксируется—хранение—микроскоп—наблюдение.