Клеточное типирование и селекция клеток. Иммуноцитохимия.

Иммуноцитохимический анализ - метод, позволяющий проводить иммунологический анализ цитологического материала в условиях сохранения морфологии клеток. ИЦХ – один из множества видов иммунохимического метода: иммуноферментного, иммунофлюоресцентного, радиоиммунного и т.п.

Основой ИЦХ-метода является иммунологическая реакция антигена и антитела. ИЦХ-методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые антигены, основываясь на их связывании с антителами. В качестве связанного с клеткой антигена выступают различные клеточные структуры: рецепторы, в т.ч. стероидных гормонов и факторов роста, белки цитоскелета, белковые продукты онкогенов и генов-регуляторов апоптоза и пр. Современные системы визуализации комплекса антиген-антитело относятся к новому поколению фермент-опосредованных методов окраски и позволяют проводить иммунологические исследования с высокой специфичностью и чувствительностью при наличии только светового микроскопа.

В онкологической практике ИЦХ позволяет: выявить молекулярные структуры опухолевых клеток, ассоциированные со степенью дифференцировки, способностью к инвазии и метастазированию, чувствительностью к химиотерапии, с особенностями течения и прогнозом заболевания у конкретного пациента. ИЦХ-анализ необходимо выполнять, когда имеются непреодолимые трудности в установлении гистогенеза опухоли; при иммунофенотипировании злокачественных лимфом; для определения источника метастазирования при невыясненном первичном очаге; для определения прогноза опухолевого процесса на дооперационном этапе и коррекции схемы лечения; с целью выбора адекватной патогенетической/таргетной терапии.

В настоящее время широко применяется метод определения гормонального статуса опухолевых клеток рака молочной железы. Экспрессия рецепторов стероидных гормонов в ядрах опухолевых клеток является показанием для гормональной терапии.

Актуален тест определения онкопротеина c-erb-B-2 (HЕR-2/neu) в клетках рака молочной железы. Гиперэкспрессия этого онкопротеина ассоциируется с повышенным метастатическим потенциалом опухоли и говорит о необходимости проведения химиотерапии даже в случае 1-2й стадии заболевания.

Для фенотипирования опухолей неясного генеза и метастазов без первичного очага применяется широкий спектр цитоспецифических маркеров:

- Calcitonin, Thyroglobulin – опухоли щитовидной железы;

- Desmin, Smooth Mucle Actin – опухоли мышечной ткани;

- НВМЕ-1 (моноклональные антитела к мезотелиальным клеткам) – мезотелиомa;

- HMB-45, S100 – меланомa;

- PLAP (моноклональные антитела к плацентарной щелочной фосфатазе) – герминогенные опухоли;

- Рецепторы Estrogen, Progesteron, CA 15-3 – опухоли молочной железы;

- Alfa-1-Fetoprotein – опухоли печени;

- CD45, CD15, CD3, CD4, CD8, CD2, CD5, CD7, CD20, CD30, CD34 - дифференциальная диагностика лимфом.

ИЦХ-анализ позволяет обнаружить даже единичные раковые клетки в лимфоузлах, костном мозге, периферической крови, уточнить на догоспитальном этапе гистогенез, степень распространения опухолевого процесса, определить прогноз заболевания и тактику лечения. ИЦХ-анализ незаменим при изучении биологических жидкостей, а возможность стандартизации технологии приготовления высококачественных тонкослойных цитопрепаратов («жидкостная» цитология) обеспечивает высокий уровень информативности и количественную оценку выявленных изменений. Срок выполнения ИЦХ-анализа 3 рабочих дня.

38.IgA, IgG, IgM: методы определения, реакция агглютинации

Методы, основанные на реакции агглютинации. Для реакции агглютинации обычно используют эритроциты (гемагглютинация) или частицы латекса (латекс-агглютинация), покрытые известным антигеном. В присутствии антител к этому антигену происходит агглютинация эритроцитов или частиц латекса.

Гемагглютинация применяется для выявления антител к тиреоглобулину и микросомальным антителам, латекс-агглютинация - для выявления ревматоидного фактора и некоторых других антител. Эти методы просты и позволяют количественно определить антиген, однако менее чувствительны, чем радиоимунный и твердофазный иммуноферментный анализы.

2. Агглютинационные методы

• 2.2 Пассивная гемагглютинация (ПГА)

• 2.3 Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

• 2.4 Обратная ПГА и реакция розетирования

 

Прямая агглютинация (определение титра антител) непрямая

 

Агглютинация:

• Прямая, непрямая

• Гемагглютинация, латекс, комплемент, др.

• Реакция нейтрализации

• На стекле, кольцевой тест в трубках

Собственно феномен гемагглютинации заключается в объединении эритроцитов в видимые невооруженным глазом агрегаты и более быстром, чем оседание свободных эритроцитов, осаждении их из раствора. Помимо открытых еще К. Ландштейнером агглютининов α и β агрегиро-вание эритроцитов могут вызывать антитела к различным эритроцитар-ным антигенам, лектины растительного происхождения, антигены и жгутики бактерий некоторых видов, некоторые вирусы, в том числе и виру-сы человека. Такую гемагглютинацию принято называть прямой или активной. Кроме этого, при закреплении на поверхности эритроцитов изначально несвойственных им антигенов, возможно агрегирование и осаждение их антителами, комплементарными таким антигенам. В этом случае агглютинацию называют непрямой или пассивной.

Осаждение эритроцитов лучше всего наблюдать в небольших объемах, вносимых в специальные углубления (лунки) на поверхности стеклянных пластинок или полистироловых планшетов для иммунологических реакций Дно таких углублений имеет форму сферы, поэтому при естественном (без агглютинации) оседании эритроцитов на дне такой лунки в центре образуется плотный осадок с ровными краями, занимающий небольшую площадь (так называемая «пуговка»). Такой результат в реакциях учитывают как отрицательный. При наличии агглютинации в зависимости от ее степени осадок появляется на большей, чем «пуговка», площади и края осадка выглядят размытыми. При самой эффективной агглютинации осадок покрывает практически все сферическое дно, формируя так называемый «зонтик» (название связано со сходством наблюдаемой картины с красным перевернутым зонтом). Одной из разновидностей реакций гемагглютинации является реакция Кумбса, применяемая для выявления неполных антител. Как уже упоминалось ранее, такие антитела закрепляются на поверхности эрит-роцитов естественным образом, поэтому если смешать суспензию эрит-роцитов с антителами, комплементарными изотипическим антигенным детерминантам иммуноглобулинов определенного класса (антииммуног-лобулинами), будет происходить их агрегирование. Такой вари-ант реакции Кумбса называется прямым и применяется для выявления уже сорбированных неполных антител. Для выявления неполных антител в плазме крови смешивают взятую от пациента сыворотку и суспензию эритроцитов другого организма, выдерживают необходимое для адсорб-ции неполных антител время и добавляют антииммуноглобулины. Такой тест называется непрямой реакцией Кумбса. Реакции выявления непол-ных антител проводят при ряде неинфекционных (гемолитическая ане-мия, желтуха)

Гемагглютинацию можно использовать для выявления определенных возбудителей болезней и антител, вырабатываемых под их воздействием

разработан метод РТПГА – реакция торможения пассивной гемагглютинации. В этом случае используют эритроциты, на поверхности которых сорбирован определенный гормон (сенсибилизированные гормоном эритроциты), и антитела, специфичные к этому гормону. Анализируемую на присутствие такого же гормона жидкость смешивают с антителами. Параллельно в качестве контроля с таким же объемом суспензии антител смешивают эквивалентное количество физиологического раствора. По истечении времени, необходимого для связывания гормона с антителами, в обе смеси добавляют суспензию сенсибилизированных гормоном эритроцитов. Если в контроле агглютинация происходит, а в опыте – нет или наблюдается снижение ее эффективности, делается вывод о присутствии гормона в анализируемой жидкости, поскольку уже связанные с гормоном антитела не могут агглютинировать эритроциты

39. Одним из наиболее распространенных вариантов таких реакций явля­ется двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони (ил. 47). Для постановки реакции в разные лунки, вносят суспензии антигенов и антител. Молекулы реагентов диффундируют в гель, и в случае соответствия антигена и ан­титела в геле между лунками образуется полоска преципитата. Иммунодиффузия получила название двойной в силу того, что оба компонента движутся в геле навстречу друг другу.

Метод позволяет анализировать сыворотки на содержание антител различной специфичности. В этом случае вокруг одной заполняемой сывороткой лунки располагаются лунки, в которые вносятся различные антигены. По сходной схеме возможно определить наличие в анализируемом растворе нескольких различных антигенов, но в этом случае анализируемый раствор вносят в центральную лунку, а лунки вокруг заполняют различными моноспецифическими сыворотками. При наличии двух или более полос между конкретными лунками делается вывод о наличии в анализируемых смесях нескольких антигенов, способных связываться с антителами сыворотки, но обладающих различной скоростью диффузии. По ширине образующихся полос преципитата можно предположительно оценивать разницу в концентрациях того или иного реагента в анализируемых смесях, однако этот метод не является истинно количественным.

Для определения количества реагирующих компонентов используется простая радиальная иммунодиффузия по Манчини. Для по­становки этой реакции один из компонентов (например, антитела) вносят в гелеобразующий раствор до застывания и перемешиванием добиваются равномерного его распространения. После застывания геля в слое обра­зуется одинаковая концентрация этого компонента в любой точке геля. После изготовления лунок их заполняют растворами, содержащими вто­рой компонент (в нашем примере молекулы антигена). В данном случае диффундирующим считается только один, вносимый в лунки, компо­нент, поэтому такая иммунодиффузия и получила название простой, а не двойной. При соответствии антигенов и антител по специфичности в си­лу равномерной диффузии по всем направлениям (отсюда название «ра­диальная диффузия») преципитат образуется в зоне, представляющей окружность вокруг лунки.

Определенными недостатками преципитации в гелях являются дли­тельность проведения реакций и нечеткость результатов при невысоких концентрациях антигенов. С целью преодолеть эти недостатки во второй половине ХХ века были разработаны методы, сочетающие белковый электрофорез и иммунопреципитацию, которые получили общее назва­ние иммуноэлектрофорез. Помимо выигрыша во времени и по­вышения разрешающей способности такие методы дают возможность более четко отличить белковые антигены, имеющие одинаковые анти­генные детерминанты, но отличающиеся по молекулярной массе. Для этого достаточно так называемого обычного иммуноэлектрофореза. Для его постановки изготавливают гель, в котором помимо обычных старто­вых лунок готовят также желобок для сыворотки. Желобок располагают между дорожками в направлении от электрода к электроду, т. е. вдоль фронта движения белков. Гель из желобка не удаляют, чтобы не нару­шать прохождение электрического тока во время фореза. Сначала в соот­ветствующем буферном растворе проводят электрофорез образцов, ана­лизируемых на присутствие искомого антигена. После снятия электриче­ского поля пластинку геля переносят во влажную камеру, из желобка удаляют гель и вместо него вносят сыворотку или суспензию монокло-нальных антител.

Описанные выше варианты иммуноэлектрофореза позволяют выявить антиген, но не определить его количество. Количественным методом (фактически модификацией иммунодиффузии по Mанчини) является так называемый ракетный иммуноэлектрофорез. Для его постановки в охлажденный до 50°С гелеобразующий раствор вносят подогретую до такой же температуры сыворотку с таким расчетом, чтобы она составляла 1-5 % геля, перемешивают и готовят пластинку геля. После внесения в лунки антигенов проводят электрофорез, условия которого подбирают так, чтобы максимально ограничить смещение молекул антител в электрическом поле (чаще всего используют барбиталовый буфер с рН 8,6 и низкое напряжение). Время электрофореза должно обеспечить выход всех молекул антигена из лунки в гель и вхождение их в состав преципитата, обычно это происходит в течение двух часов. Преципитаты в таких условиях образуются в зонах по ходу движения антигена, которые имеют форму вытянутого конуса (ракеты). Длина зоны образования преципитата пропорциональна концентрации антигена, что дает возможность, измерив длину «ракеты» и используя специально построенный калибровочный график, определить количество антигена в пробе.

Вариантом ракетного иммуноэлектрофореза является так называемый перекрестный электрофорез. Для его постановки готовят обычной гель и проводят обычный электрофорез анализируемой пробы. При этом ис­пользуют одну пробу и лунку располагают у одного из краев пластинки. После проведения электрофореза часть пластинки (около 4/5 от исходно­го размера) отрезают и удаляют, оставляя только ту часть, в которой на­ходится дорожка первого электрофореза. Затем в ту же камеру заливают гелеобразующий раствор с сывороткой так, чтобы оставшийся участок пластинки объединился с новым, содержащим сыворотку, гелем. Меня­ют положение пластинки (или электродов) так, чтобы направление дви­жения антигенов было перпендикулярным тому, которое было при пер­вом форезе, и проводят второй форез в условиях, как для ракетного.