Флуориметрия и методы на ее основе. Флюоресцентная и конфокальная микроскопия. Локализация антигенов.

В настоящее время одним из основных методов выявления различных макромолекул является их иммунофлуоресцентное маркирование. Данный метод высокоспецифичен, т.к. в его основе лежит взаимодействие антител с антигенами. Он может применяться для определения локализации антигена в клетке. Для регистрации флуоресцентного сигнала используется флуоресцентная и конфокальная микроскопия.

Изобретение конфокальной системы фильтрации сигнала обеспечило измерение флуоресцентных сигналов с трёхмерным субмикронным разрешением и существенно расширило возможности неразрушающего анализа прозрачных образцов. Еще два изобретения 20 века – лазер и компьютер – послужили мощным стимулом для бурного развития новых методов лазерной флуоресцентной микроскопии: лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ), микроспектроскопии, многофотонной микроскопии, микроскопии на основе измерения времени жизни флуоресценции, микроскопии с применением эффекта полного внутреннего отражения и 4Pi микроскопии. Несмотря на значительное усложнение техники измерений и обработки результатов, новые методы получили широкое распространение. Развитие генной инженерии, протеомики, биотехнологии, современной фармацевтики и биомедицины способствовало быстрому внедрению новых методов оптической микроскопии.

Преимущества конфокального микроскопа перед флуоресцентным состоят в том, что регистрируется флуоресценция из одной фокальной плоскости, что позволяет получить более контрастное, неразмытое изображение. Конфокальный микроскоп позволяет также получить качественные микрофотографии, готовые для дальнейшей компьютерной обработки.

В РИФ используются антитела или антигены, связанные с флюорохромами – веществами, способными излучать свет определенной длины волны при облучении их светом с друг ой длиной вол ны (например, ультрафиолетом). Разрешающая способность таких реакций выше, чем у всех описанных в предыдущих разделах, потому, что в данном случае имеется возможность обнаруживать очень небольшие комплексы антиген–антитело с помощью флюоресцентного микроскопа. Кроме того, применение конъюгированных с флюорохромом антител дает возможность обнаруживать трудно переводимые в раствор антигены, например белки наружной цитоплазматической мембраны клеток или какие-либо молекулы, прочно связанные с межклеточным веществом тканей, при микроскопировании срезов. При этом удается определить не только наличие антигенов, но и места их преимущественной локализации в анализируемых образцах, что в некоторых случаях и является главной целью исследования. Чаще всего в подобных реакциях используют связанные c флюорохромом иммуноглобулины. В качестве хорошо связывающихся с белками флюорохромов применяют флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), тетраметилромадинизотиоцианат (ТРИТЦ), которые излучают в зеленой части спектра, и фикоэритрин, который при возбуждении светом такой же длины волны дает красный свет. Это позволяет при необходимости использовать так называемое «двойное окрашивание» и в одном анализе выявлять разные антигены. Для определения локализации антигена в клетке используют флуорохромы, имеющие сродство к определенным компартментам или структурам клетки, и антитела, меченные флуорохромами, испускающими свет другой длины волны. Клетку обрабатывают флуорохромами, затем мечеными антителами. Микроскопируют с помощью конфокального или флуоресцентного микроскопа. Если спектры накладываются, то АГ локализован в нашем компартменте.

Различают три основных варианта РИФ. Так называемая прямая иммунофлюоресценция заключается в обработке анализируемого препарата (среза тканей или мазка, приготовленного из суспензии клеток) антителами, связанными с флюорохромами. После отмывания препарата от несвязавшихся антител его просматривают в флюоресцентном микроскопе. Непрямая флюоресценция включает два этапа. Сначала препарат обрабатывают обычными («несветящимися») антителами конкретного вида животных. После отмывания проводят обработку конъюгированными с флюорохромом антителами, специфическими к антигенным детерминантам использованных в первой обработке антител («светящимися» антииммуноглобулинами). Отмытый после второго этапа препарат подвергают микроскопированию. Хотя эта реакция требует большего времени на постановку, ее разрешающая способность выше, поскольку, как правило, на одно «несветящееся» антитело осаждается не одно, а несколько «светящихся». Кроме того, такой метод позволяет работать с очень разными антигенами, используя одну суспензию связанных с флюорохромами иммуноглобулинов, т. е. отпадает необходимость проводить конъюгирование с флюорохромом иммуноглобулинов каждой вновь получаемой сыворотки или суспензии моноклональных антител. Третий вариант – непрямая иммунофлюоресценция с применением комплемента – основан на том, что при активации по классическому пути молекулы системы комплемента образуют комплексы именно там, где имеются закрепленные иммуноглобулины. В этом случае необходимы три этапа обработки препарата: «несветящимися» антителами, комплементом и конъюгированными с флюорохромом иммуноглобулинами, специфичными по отношению к белкам системы комплемента. Иммунофлюоресценция позволила разработать уникальный по своим возможностям метод отбора нужных клеток из смешанных суспензий. Такую суспензию (например, фракцию лейкоцитов крови человека) подвергают обработке иммуноглобулинами двух разных типов: одни из них комплементарны специфическому антигенному маркеру клеток определенной группы (например, Т-клеток) и мечены дающим при возбуждении зеленый свет флюорохромом, вторые – маркеру другой группы (например, В-лимфоцитов) и мечены флюорохромом, испускающим при возбуждении той же длиной волны красный свет. Затем смесь помещают в прибор FACS (от англ. fluorescence activated cell sorter), который в русскоязычном варианте чаще всего называют «лазерный проточный цитометр». Клетки в тонкой струе жидкости по одной пропускаются через луч лазера с длиной волны, возбуждающей свечение в конъюгированных с антителами флюорохромах. Сложная оптическая система прибора регистрирует сразу несколько параметров прошедшей через луч клетки: ее размеры, наличие цитоплазматических гранул и испускаемый свет. В зависимости от информации, поступившей из оптического блока в механический блок, сепаратор направит клетку с определенными характеристиками в нужный сосуд. Одновременно связанная с прибором компьютерная система регистрирует, сколько и каких клеток было проанализировано, что позволяет кроме сортировки получить количественные данные о составе изучаемой суспензии. Недостатками реакций иммунофлюоресценции является невозможность их применения к объектам, молекулы которых могут флюоресцировать, и невысокая точность определения количеств анализируемых антигенов.

 

41.Иммуномагнитные методы используются для селекции клеток.1)позитивная (к антителам присоединяются нужные клетки)

2)негативная (присоединяются ненужные клетки)

Используются для диагностики патогенов чела и животных.

Магнитные свойства носителей таких сорбентов делают их управляемыми в магнитном поле, что обеспечивает возможность автоматизации процесса при работе с ними. Выступая в качестве твердой фазы, иммуномагнитные сорбенты нашли применение в комплексе с иммунофлюоресцентным, биолюминесцентным и амплификационным методами индикации ряда возбудителей

Обогащение клеточных популяций: 1)facsscan (на CD-маркере), 2) Обогащение фагоцитами.