Способы мечения антител и визуализации комплексов антиген-антитело

Метки:

- радиоизотопы (изотопы иод131 и иод125 используют для мечения АТ, а изотопы фосфор32 и тритий – АГ)

- ферменты (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза_

- флюорохромы (флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), тетраметилромадинизотиоцианат (ТРИТЦ), которые излучают в зеленой части спектра, и фикоэритрин, который при возбуждении светом такой же длины волны дает красный свет),

- металлы и металлопротеины

Промежуточные связующие вещества:

- биотин

- дигоксин

В агглютинационных и преципитационных тестах регистрация комплексов АГ-АТ осуществляется визуально, для лучшей визуализации осадка применяются красители, имеющие высокое сродство к белкам (кумасси синий), эритроциты (реакции гемагглютинации).

Для того чтобы визуализировать результаты РИА используют радиометры, позволяющие регистрировать интенсивность радиоактивного излучения.

Для визуализации реакций иммунофлюоресценции (РИФ) используются флюоресцентные и конфокальные микроскопы.

Для регистрации результатов ИФА используется спектрофотометр. Иногда результаты можно учитывать визуально.

24.Количественные, полуколичественные, качественные методы определения.

Полуколичественные( Семиколичественные): (иногда точную конц-ю оределить нельзя; определяют >или< чем ожидалось или чем в норме, по сравнению с др. позволяет сориентироваться в разных положениях.)

Конкурентный.

Зональный электрофорез - полуколичественный метод, позволяющий разделить смесь белков в зависимости от их молекулярной массы и электрического заряда.

Двойная радиальная иммунодиффузия - полуколичественный метод, с помощью которого можно не только выявить антигены, но и оценить степень сходства между ними.

Качественный:

Иммуноэлектрофорез. Суть:- проводят электрофоретическое разделение белков в геле; - по окончанииэлектрофореза в еле параллельно направлению электрофореза вырезают бороздки; - в бороздки вносят антитела (антисыворотку), например к тяжелым (альфа, дельта, эпсилон, гамма, мю) или легким (лямбда, каппа) цепям иммуноглобулинов. Эти антитела и разделенные при электрофорезе белки диффундируют навстречу друг другу. Электрофорез с иммунофиксацией. Этот метод основан на электрофоретическом разделении белков сыворотки в геле с последующей инкубацией геля в присутствии антител к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов.

Иммуноблоттинг - качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом: - смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану; - мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем - с мечеными антителами к иммуноглобулинам. Количественные: (конц-я, титр, ур-нь)

Простая радиальная иммунодиффузия позволяет количественно определить содержание антигена в исследуемой пробе.

Нефелометрия - определение концентрации взвешенных частиц и высокомолекулярных веществ в растворе, основанное на оценке интенсивности рассеяния света, проходящего через этот раствор. Нефелометрия может быть использована для определения концентрации антигенов.

Твердофазный иммуноферментный анализ применяют для к оличественной оценки антител и антигенов. По чувствительности он сопоставим с радиоиммунным анализом, но более прост, дешев и не требует применения радиоактивных изотопов.

Непрямая иммунофлюоресценция - метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. В качестве источника антигена обычно используют срезы тканей или культуры клеток.

Гемагглютинация применяется для выявления антител к тиреоглобулину и микросомальным антителам, латекс-агглютинация - для выявления ревматоидного фактора и некоторых других антител. Эти методы просты и позволяют количественно определить антиген, однако менее чувствительны, чем радиоимунный и твердофазный иммуноферментный анализы.

25. Ос­новой метода является обратимость реакций антиген-антитело. Хрома-тографическую колонку заполняют гранулами несорбирующего белки вещества, с которым ковалентно связаны молекулы конкретного антиге­на. Затем через колонку пропускают раствор электролитов, обеспечи­вающий условия связывания антигенов и антител и далее смесь такого раствора с сывороткой. По мере прохождения через колонку на запол­няющем ее веществе будут осаждаться только специфичные по отноше­нию к выбранному антигену антитела. После прохождения всего объема раствора, содержащего сыворотку, колонку промывают несколькими объемами исходного раствора электролитов для полного удаления всех несвязавшихся антител. Последним этапом является пропускание через колонку раствора, вызывающего диссоциацию комплексов антиген-антитело, что приводит к элюции (смыванию) нужных антител. Выходя­щую из колонки суспензию собирают и используют для постановки ре­акций.

Недостатками такого метода является небольшое количество нужных антител, получаемых из значительных объемов сыворотки, и отсутствие полной идентичности отбираемых таким методом антител. Последнее связано с тем, что при использовании поливалентного антигена в суспензии окажутся антитела, специфичные по отношению к разным антигенным детерминантам этого антигена, поскольку при иммунном ответе организма образовывались разные клоны плазматических клеток. Иначе говоря, такая суспензия, хотя и будет высокоспецифичной, останется все равно поликлональной.

Иммуносорбция. Не нужна колонка. Достаточно иметь гранулы с а/т. Есть суспензия различных а/г. Далее гранула с а/т связывается со специфичным а/г и выпадает в осадок. Если надосадочная жидкость не нужна, то она выливается.

Самое дорогое – это гранулы. Применяется для концентрирования малых количеств.