Western-блотинг.Dot-blot. Системы детекции и амплифкации сигнала.

Иммуноблоттинг - качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом:

- смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану;

- мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем - с мечеными антителами к иммуноглобулинам.

Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного иммуноферментного анализа при диагностике ВИЧ- инфекции.

Dot-blot: упрощ. модель вестерна. Не надо разделение электрофорезом.Dot-пятнышко. Пятнышко с р-ром смеси белков. Испол. если концентрация очень мала. Позволяет сконцентрировать белок. Смотрим, взаимодействует ли с а\т. Можно наносить механически, а можно с помощью аппарата. Есть панель с дырочками(96) на нее мембрана на нее 96-луночная панель(лунки соотв. дырочкам). В лунки загоняется жидк. проходит вниз белки оседают на мембрану.

Каждое пятнышко или полосочку можно разрезать на несколько частей, затем анализ.

Проявление при помощи ферментных способов(нер-римые субстраты), иммунофлюор. м-ды.

Амплификация сигнала 1.

Прямой (А) и непрямой (Б) метод визуализации
результатов реакции «антиген-антитело»

Преимущества Б:

• вторичные антитела против Fc-фрагмента другого вида животного получать намного проще, также легче присоединить к ним метку;

• первичные антитела не несут на себе лишнего груза, а значит, легче и быстрее проникают в ткани, метка не влияет на конформационные изменения после взаимодействия антител с антигеном.

Амплификация сигнала 2.
- системы с использованием антител против пероксидазы и щелочной фосфатазы (PAP и APAAP-комплексы).

1 этап: первичные антитела

2 этап: вторичные антитела против первичных (связующее антитело)

3 этап: вносятся антитела против пероксидазы или щелочной фосфатазы, полученные от животного того же вида, от которого получены первичные антитела, антигенсвязывающие участки которого заняты соответствующим ферментом.

Формируется комплекс, где с одним антигеном связываются уже 2 молекулы фермента

АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 3
- метод непрямого иммуноокрашивания с использованием биотин-авидинового комплекса (1979)

Биотин

- является коферментом во многих реакциях присоединения (карбоксилирования).

- соединение, стойкое к действию высоких температур, к кислой и щелочной среде, хорошо растворяется в воде и спирте.

- легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами.

- содержится в большом количестве в белках птичьих яиц, где он связан с авидином

Авидин

• образует с биотином чрезвычайно стойкий комплекс: К(А)=10(15) моль(-1)

• гликопротеид с молекулярной массой 68 кДа

• имеет 4 места связывания, к которым можно присоединить биотин или белки

АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 4
применение полимерных систем

Основой систем является декстрановая молекула, на которой конъюгируют до 20 молекул первичных или вторичных антител и 100 молекул фермента

АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 5
системы, основанные на применении тирамида

Тирамид, предварительно связанный с биотином, под действием пероксидазы переходит в нерастворимую форму и оседает в ткани около фермента. Затем добавляют комплекс стрептавидин-пероксидаза, который присоединяется к тирамиду и усиливает ферментативную активность в месте связывания во много раз.

Первые три этапа такие же, как в ABC-методе. Последующие этапы:

А – в систему добавляют тирамид, связанный с биотином;

Б – под действием пероксидазы тирамид переходит в нерастворимую форму и оседает вокруг комплекса «антиген-антитело».

В – в систему добавляют комплекс стрептавидин-биотин-фермент, который связывается с биотином, связанным с тирамидом.

Детекция- визуальная оценка

Метод иммунного блоттинга

 

В практике лабораторной диагностики инфекционных заболеваний существует иногда необходимость определять антитела не вообще к патогену, а к определенным его белкам (антигенам), то есть спектр специфических антител.

Иммунный блотинг позволяет определять в сыворотке крови антитела одномоментно и в то же время дифференцированно ко всем диагностически значимым белкам патогена. Перевод с английского Western blot означает западный перенос (дословно — промакивание).

Этапы:

На первом этапе этого метода осуществляют электрофоретическое разделение смеси белков патогена в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). ДСН, являясь поверхностно активным веществом, равномерно обволакивает молекулы белка и придает всем им отрицательный заряд приблизительно равной величины. Поэтому молекулы движутся в электрическом поле в одном направлении, а скорость продвижения зависит только от размеров молекулы (молекулярной массы) белка.

В результате электрофоретической процедуры получают гелевую пластину, в толщине которой в виде отдельных тонких линейных зон располагаются белки. По направлению движения они разделяются в следующем порядке: ближе к старту находятся белки большой молекулярной массы, порядка 120—150 кДа, а к финишу далее всех продвинулись протеины массой 5—10 кДа.

На втором этапе гелевую пластину накладывают на лист нитроцеллюлозы и помещают эту конструкцию между электродами источника постоянного тока (рис. 21.26). Под действием электрического поля белки перетекают из пористого геля на более плотную мембрану, где достаточно прочно закрепляются.

Полученный блот обрабатывается блокирующим раствором, содержащим индифферентные в антигенном отношении белки и/или неионные детергенты (Твин 20), которые блокируют на мембране свободные от антигена места. Затем лист-мембрану разрезают на узкие полоски таким образом, чтобы каждая полоска содержала все антигенные фракции. Описанные этапы выполняются фирмой-производителем.

В результате последовательного проведения иммунных и ферментативной реакции при наличии в исследуемой пробе антител к белкам патогена на блоте появляются темные поперечные полоски, расположение которых находится в зоне определенных белков патогена. Каждая такая полоса свидетельствует о наличии специфических антител к соответствующему антигену. Результат исследования, проведенного методом иммунного блотинга, выдается в виде перечисления антител к конкретным белкам патогена. Например: «выявлены антитела к белкам р17 и р24».

Нитроцеллюлозные блоты после проявления могут долго храниться в высушенном виде. Однако интенсивность окраски при этом значительно ослабевает. Влажные блоты можно фотографировать или с помощью сканеров вводить их графическое изображение в память персональных компьютеров. Специальные компьютерные программы позволяют обрабатывать полученные результаты и оперативно отслеживать динамику спектра антител при динамическом наблюдении.

Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции.

Клеточный ИФА. ELISpot. Поляризационный флуороиммуноанализ (ПФИА).

Клеточный ИФА.

В роли антигена выступает целая клетка. Используется, например, в диагностике уреаплазмоза.

Проходит все стадии ИФА.