Антгены и иммуногены. Антигенные детерминанты, эпитопы. Гаптены.

Первичный иммунный ответ

Появлению антител (АТ) предшествует латентный период продолжительностью 3~5 сут. В это время происходит распознавание Аг и образование клонов плазматических клеток. Затем наступает логарифмическая фаза, соответствующая поступлению антител (АТ) в кровь; её продолжительность — 7-15 сут. Постепенно титры антител (АТ) достигают пика и наступает стационарная фаза, продолжительностью 15-30 сут. Её сменяет фаза снижения титров AT, длящаяся 1-6 мес. В основу пролиферации клеток-продуцентов AT заложен принцип селекции. В динамике антителообразования титры высокоаффинных AT постепенно нарастают: после иммунизации аффинность AT к Аг постоянно увеличивается. Первоначально образуются IgM, но постепенно их образование уменьшается и начинает преобладать синтез IgG. Так как переключение синтезов от IgM к IgG не меняет идиотипа AT (то есть его специфичность по отношению к конкретному Аг), то оно не связано с клональной селекцией. Особенности первичного ответа — низкая скорость антитело -образования и появление сравнительно невысоких титров AT.

Рис. 10-11. Динамика образования антител (АТ) при первичном и вторичном иммунных ответах. По оси абсцисс — время (сут), по оси ординат — титр AT (разведения).

Вторичный иммунный ответ

После антигенной стимуляции часть В- и Т-лимфоцитов циркулирует в виде клеток памяти. Особенности вторичного иммунного ответа — высокая скорость антителообразования, появление максимальных титров антител (АТ) и длительное (иногда многолетнее) их циркулирование.

Основные характеристики вторичного имунного ответа:
• образование антител (АТ) индуцируется значительно меньшими дозами Аг;
• индуктивная фаза сокращается до 5-6 ч;
• среди антител (АТ) доминируют IgG с большой аффинностью, пик их образования наступает раньше (3-5 сут);
• Антитела (АТ) образуются в более высоких титрах и циркулируют в организме длительное время

 

Методы получения антител

ПКА – из крови иммунизированного животного.

МКА – гибридомная технология. Из иммунизированного животного (мыши) извлекают селезенку, получают В-клетки. Отдельно растят мутантные плазмоцитомы, чувтвительные к ГАТ-среде (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Слияние В-клеток (берут в 2-кратном избытке) с плазмоцитомами – с помощью ПЭГ или электропорации. Полученные гибриды помещают на ГАТ-среду – растут только гибридомы – В-клетка+плазмоцитома. Сформировавшиеся клоны проверяют на способность продуцировать антитела и отбирают те из них, которые дают антитела к использованному для иммунизации животного антигену. Часть клеток из каждого такого клона консервируют путем замораживания при температуре жидкого азота, а сам клон подвергают расчистке. Суть расчистки заключается в разделении клона на изолированные клетки, получении их потомства и анализе этого потомства на однородность и продукцию атител. При необходимости проводят несколько последовательных расчисток. На каждом этапе расчистки часть клеток каждого клона также консервируют, чтобы в случаях гибели клона была возможность не повторять процедуру с начала, а продолжить ее с конкретного этапа. Полученные стабильные, не дающие расщепления клоны являются источниками гибридом, пригодных для получения абсолютно однородных по специфичности и изотипу антител, которые и называют монокло-нальными. Наработку нужного количества антител осуществляют либо побуждая гибридомные клетки к продукции антител в культуре, либо вводя суспензию таких гибридом в организм специально подготовлен-ных лабораторных животных.

РАТ (рекомбинантные АТ) создаются на основе известных последовательностей генов АТ. Получены с использованием технологий молекулярной биологии и генной инженерии. Клонируются гены, сегменты иммуноглобулинов – получают генный репертуар. Получают новые конструкции. Селекция. Для получения РАТ используют вирусы (обычно фаги – фаговые библиотеки), бактерии и дрожжи (для клонирования генов; в дрожжах и др.эукариотических клетках происходит гликозилирование иммуноглобулинов, у прокариот не осуществляется). Получают различные типы РАТ: замещенные, минимальные (Vдомены, Fv-фрагменты, sc-Fv, минимальные узнающие пептиды, иммуноадгезины, абзимы)

 

Стадии получения МКА и ПКА

1) Выбор подходов и средств к иммунизации

· Тип АТ (ПКА, МКА) в зависимости от поставленной цели, для которой будут использованы АТ, и теста, в котором они будут применяться

· Выбор животного, продуцирующего АТ (по размеру – в зависимости от типа получаемых АТ – ПКА или МКА, и необходимого количества АТ. Животное должно быть филогенетически удалено от АГ. Выбирают не только по виду, но и специфические линии. Животные должны быть стерильны, т.е. не инфицированы. Как правило, используют самок, т.к. у них лучше выражен иммунный ответ, особенно в период полового созревания. Используют молодых животных)

· Выбор типа АГ (иммуногена)

· Выбор носителя для гаптена (Носитель должен быть филогенетически удален от иммунизируемого животного, имеет много антигенных детерминант, т.е. и сам является хорошим антигеном и иммуногеном)

2) Подготовка иммуногена

· Определение эпитопов АГ (с помощью специальных программ, тестов)

· Выделение и очистка АГ – для натуральных, естественных, или синтез пептида/гаптена – для искусственных. Антиген должен быть чистым, без примесей, стерильным (фильтрование через поры диаметром 0,22 мкм). Если синтетический пептид, то в нем не должно быть обширных гидрофобных областей, длинных повторов одной а/к (сер, тре, вал), не должен начинаться и заканчиваться на глу, про, асп.

· Сшивка с носителем. Сшивка с носителем химически – с помощью кросс-линкеров. Различные кросс-линкеры используют для сшивки различные группы. Если в качестве АГ используется небольшой пептид, то можно сшить между собой 2 его молекулы с помощью глутарового альдегида. Есть специфические кросс-линкеры, сшивающие аминогруппу одного белка и сульфидную группу другого, т.е. обеспечивают пришивание в определенном положении (сульфо-MSB). Различные кросс-линкеры необходимы для того, чтобы не получить антитела на сам кросс-линкер.

· Контроль качества, стерильности (высевом), токсичности (на культуре клеток). Необходимо убедиться, что АГ свободен от липополисахаридов бактерий, полиакриамидного геля, додецилсульфата натрия, мочевины, других органических примесей, чтобы рН не был экстремальным – если надо, то забуферить.

3) Иммунизация

· Доза

· Периодичность инъекций

· Количество инъекций

· Способ инъекций

· Контроль (отбор проб, титры)

АГ вводится в 2-3-4 приема с интервалами не менее 20 дней (учитывая схему развития иммунного ответа).

Первая инъекция – премирующая – самая высокая доза АГ, используется полный адъювант Фрейнда. Следующие инъекции – бустирующие (поддерживающие) – уменьшается доза, используется неполный адъювант Фрейнда. Перед забором крови для приготовления сыворотки или перед забором селезенки последние терминальные инъекции делаются с интервалом в 1 день, но минимальной дозой.

Способ инъекции зависит от типа АТ (ПКА или МКА). Для МКА – в перитониум, ближе к селезенке (интраперитониально). Для ПКА – подкожно (у кроликов – в лопатку, бедро).

Забор крови для определения титра АТ у кроликов и мышей – из уха.

4) ПКА – забор крови для приготовления сыворотки. У кролика – из уха, у мыши – из хвоста.

МКА – забор селезенки, гибридомная технология.

5) Очистка АТ

ПКА – аффинная хроматография, истощение сыворотки.

МКА – хроматография, высаливание.

6) Контроль качества АТ

· Определение концентрации или титра АТ

· Выявление кросс-реактивности

· Определение изотипа. С помощью ИФА. Получают АТ к различным типам тяжелых и легких цепей. Изотип записывают в паспорт АТ.

· Обычно для МКА эпитопная характеристика – метод взаимодействия с перекрывающимися пептидами.

7) Модификация АТ (метка) осуществляется с помощью кросс-линкеров. Метки: радиоактивные, ферменты, биотин.

8) Хранение

Лиофилизация (высушивание из замороженного состояния) – наилучший способ хранения белка.

Замораживание (-20, -40; -80 – лучшее, т.к. при -80 не действуют протеазы). Модифицированные АТ при замораживании – размораживании могут терять метку, поэтому их хранят при глубоком замораживании с криопротектором.

8. иммунизация. Прививание – в основном 3 раза. BCG. а/г вводиться в 2-3-4 приема с интервалами не менее 20 дней(учитывая схему развития иммунного ответа; чтобы после первого введения развился максимальный, потом сошел на нет).

Подготовка иммуногена. А/г не должен содержать примесей. Рекомбинантные белки- полученные введением чужеродных генов в клетку продуцента. Должен быть стерильным. Белок не должен денатурировать. Эпитоп определили. Необходимо пришить а/г на носитель. Пришивается гаптен химически – кросслинкеры.

Контроль качества, стерильности(высевом), токсичности(на к-ре клеток).

9 требования к свойствам моноклональных антител:

1) Гомогенны,2)стерильны,3) кроссреактивность не должна проявляться.

Фаговый дисплей антител

Первыми белковыми молекулами, успешно «представленными» на поверхности нитевидных бактериофагов, были иммуноглобулины, а точнее их антигензсвязывающие фрагменты (scFv или Fab). Обычно после процедуры выделения и очистки Fab-фрагменты являются более стабильными по сравнению с scFv-фрагментами антител. Также из Fab-фрагментов сравнительно легко можно получить полноразмерные иммуноглобулины. Для этого к С-концевой части С_Н1-домена присоединяют Fc-фрагмент.

Технология фагового дисплея антител происходит следующим образом. В фагмиде (pCES1) конструируют ген, в котором последовательность, кодирующая вариабельный и первый константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H и С_Н1), объединяют в правильной рамке трансляциии с геном III нитевидного фага fd.

Вторая, дополняющая цепь Fab-фрагмента, состоящая из вариабельного и первого константного домена легкой цепи иммуноглобулина (V_L и С_L), экспрессируется отдельно. Сигнальная последовательность (S) направляет экспрессированные белки в периплазму бактериальной клетки. После секреции в периплазматическое пространство клетки обе цепи ассоциируют и образуют активный Fab-фрагмент иммуноглобулина.

 

14. Проблема решается с помощью метода «гуманизации» мышиных антител. Суть метода заключается в создании генетических структур, которые объединяют V-гены мышиных моноклональных антител и С-гены иммуноглобулина человека необходимого изотипа. В результате специфичность образующихся гибридных антител определяются генами мыши, а их антигенные свойства — преимущественно генами человека. Более сложный, но радикальный способ заключается в объединении гипервариабельных частей V-генов мыши с человеческими С-генами и генами, кодирующими каркасную последовательность V-гена.Методы «гуманизации» моноклональных антител открывают перспективу получения больших объемов моноклональных антител, которые могут использоваться для иммунотерапии самых разнообразных патологических состояний у человека.

Фьюжин-белки используют для иммунизации и для того чтобы а/т не деградировало в организме (пришивают БСА) и т.о. увеличивается продолжительность жизни а\т.

ПЕГ-антитела –полиэтиленгликоль пришивается к молекулам на свободные хвосты, расчепляющиеся протеазами крови,и фермент не могут сесть на свое место и а/т будет циркулировать. (сывороточный альбумин).

 

ТИПЫ НАНОЧАСТИЦ

1. Липосомы состоят из мембраны в виде бислоя липидов и молекулы воды внутри, имеют сродство к биологической мембране и используются для повешения эффективности и безопасности использования лекарств.

2. Эмульсии содержат масла в водной фазе, стабилизированные сурфактантом, который поддерживает размер и форму.

3. Полимеры

· полисахаридные хитозановые наночастицы, используются для доставки лекарств. Водорастворимые полимерные гибриды (полимерпротеин – снижает иммуногенность, увеличивает продолжительность полужизни в плазме, повышает стабильность протеинов; и полимерлекарство канъюгаты – целевая доставка к опухоли за счет повышения проницаемости)

4. Керамические наночастицы

5. неорганические поросодержащие биосовместимые могут в подвергаются биодеградации, поэтому могут накапливаться вызывать нежелательные эффекты. Используются в раковой терапии.

6. Металлические наночастицы

· Используются как пассивные или активные транспартеры лекарств.

7. Наночастицы – золотые скорлупки (gold shell)

· сферические наночастицы с диэлектрическим ядром, покрытым тонкой металлической скорлупкой, обычно золотой. Используются для визуализации при биомедицинских исследованиях и терапевтических процедурах

8. Карбоновые наноматериалы: фуллерены и нанотрубки

·. Используются для доставки терапевтических молекул.

9. Quantum dots

· Полупроводники с флюоресцентными свойствами, могут быть покрыты другими материалами, предотвращающими утечку тяжелых металлов.

Биотин

- является коферментом во многих реакциях присоединения (карбоксилирования).

- соединение, стойкое к действию высоких температур, к кислой и щелочной среде, хорошо растворяется в воде и спирте.

- легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами.

- содержится в большом количестве в белках птичьих яиц, где он связан с авидином

Авидин

• образует с биотином чрезвычайно стойкий комплекс: К(А)=10(15) моль(-1)

• гликопротеид с молекулярной массой 68 кДа

• имеет 4 места связывания, к которым можно присоединить биотин или белки

 

АВС метод
Недостатки авидин соединяется с эндогенным биотином, который в большом количестве содержится в печени и почках,

• авидин может соединяться с лектинами и заряженными группами в тканях, так как авидин имеет заряд (рI 10,0).

стрептавидин – белок с молекулярной массой около 60 кДа, который получают из микроорганизмов Streptomyces avidinii (SaBC-метод)

не имеет заряда в нейтральной среде, не связывается с эндогенным ферментами и намного меньше с эндогенным биотином. Замена авидина на стрептавидин позволила резко уменьшить фоновое окрашивание и повысить чувствительность метода приблизительно в 8 раз

АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 4
применение полимерных систем

Основой систем является декстрановая молекула, на которой конъюгируют до 20 молекул первичных или вторичных антител и 100 молекул фермента

 

АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 5
системы, основанные на применении тирамида

 

Тирамид, предварительно связанный с биотином, под действием пероксидазы переходит в нерастворимую форму и оседает в ткани около фермента. Затем добавляют комплекс стрептавидин-пероксидаза, который присоединяется к тирамиду и усиливает ферментативную активность в месте связывания во много раз.

Первые три этапа такие же, как в ABC-методе. Последующие этапы:

А – в систему добавляют тирамид, связанный с биотином;

Б – под действием пероксидазы тирамид переходит в нерастворимую форму и оседает вокруг комплекса «антиген-антитело».

В – в систему добавляют комплекс стрептавидин-биотин-фермент, который связывается с биотином, связанным с тирамидом.

Неспецифическое связывание.

Способность антител дифференцировать антигены хорошо иллюстрируются различной реактивностью антител по отношению к близким по химической структуре гептенам. Антисыворотка, полученная к одному антигену, может перекрёстно реагировать с родственным антигеном, несущим одну или несколько идентичных или похожих детерминант. Речь идёт о поликлональных антителах. (если кто-то знает, что это не то, поправьте)

 

22 Система контролей: 1)позитивный,(как должно быть);

2)негативный (когда неспецифическое связывание,когда берем другое а/т вместо первого)

3) изотип контроль для иммуногистологии (каждый изотип имеет Fc – фрагмент). Например,береміммуноглобулін Gокрашиваем,идоказываем,что вторичное антитело не распознают любую часть молекулы.

Контроли нужны всегда. Нужно контролировать бэкграунд. Если сэндвич м.б.ошибки: плохой а/г, первичное а/т. Иммунофлюорография: негат, изотип-контроль – произаодят а/т, которые не к чему не направлены: 1 препарат – специфические а/т, 2 препарат – изотип контроль(если окрашивание, то бэкграунд).

Конкурентный ИФА.

Этот вариант анализа основан на конкуренции меченых (конъюгат) и немеченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе. Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител. Для определения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый антиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы.

Конкурентный метод требует минимального числа операций, незначительного расхода реагентов и легко может бытъ автоматизирован. При проведении конкурентного ИФА для выявления антител лучше использовать меченые моноклинальные антитела, тогда конкуренция конъюгата с исследуемым образцом происходит за единственный эпитоп адсорбированного на твердой фазе антигена. Этот вариант ИФА применяется для определения различных соединений, таких как иммуноглобулины человека, раково-эмбриональный антиген, инсулин и др. Он позволяет выявлять антитела к диагностически значимым эпитопам инфекционных агентов.

Основные этапы анализа для выявления антигена (рис.5):

1. На твердой фазе иммобилизуют специфические для выявляемого антигена моноклональные антитела.

2. В лунки панелей вносят в известной концентрации антиген, меченный ферментом, и исследуемый образец. Проводят инкубацию и отмывку. Параллельно в соседних лунках ставят положительный и отрицательный контроли. Для построения калибровки используют стандартный немеченый антиген в различных разведениях.

3. Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают реакцию при развитии оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.

4. Учет реакции на ИФА-ридере.

В этом случае количество антигена в исследуемом образце обратно пропорционально ферментативной активности на твердой фазе.

Рисунок 5. Конкурентный ИФА Рисунок 6. Ингибиторный ИФА

30.ИФА. Принцип. Типы ИФА.

Методы иммунного анализа широко вошли в медицинскую практику. Во всех областях современной медицины используется иммунный анализ, преимущественно, с диагностической и аналитической целями. Особенно важно, что они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты иммунной системы, антигены и т.д.) в низких и очень низких концентрациях. Все продукты, против которых возможно получение антител, выявляются этими методами.

Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Оценка реакции проводится автоматически на специальной аппаратуре, что позволяет стандартизировать эти методы.

В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и другие. При постановке реакций в один или несколько этапов они обозначаются как прямые или непрямые. Имеет значение среда, в которой проводится реакция. Если реакция проводится с реагентами, фиксированными на поверхности, то тест обозначается как твердофазный, например ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).

В данной работе будет рассмотрен только иммуноферментный анализ – метод широко распространенный в биологии и медицине, как практической, так и фундаментальной.

Иммуноферментный анализ.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.

 

Рисунок 1. Основной принцип ИФА.

1) Для выявления антигенов. 2) Для выявления антител.

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результате реакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 1).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:

[AT]+[АГ]↔[АТАГ]

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

Метод иммунного блоттинга

 

В практике лабораторной диагностики инфекционных заболеваний существует иногда необходимость определять антитела не вообще к патогену, а к определенным его белкам (антигенам), то есть спектр специфических антител.

Иммунный блотинг позволяет определять в сыворотке крови антитела одномоментно и в то же время дифференцированно ко всем диагностически значимым белкам патогена. Перевод с английского Western blot означает западный перенос (дословно — промакивание).

Этапы:

На первом этапе этого метода осуществляют электрофоретическое разделение смеси белков патогена в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). ДСН, являясь поверхностно активным веществом, равномерно обволакивает молекулы белка и придает всем им отрицательный заряд приблизительно равной величины. Поэтому молекулы движутся в электрическом поле в одном направлении, а скорость продвижения зависит только от размеров молекулы (молекулярной массы) белка.

В результате электрофоретической процедуры получают гелевую пластину, в толщине которой в виде отдельных тонких линейных зон располагаются белки. По направлению движения они разделяются в следующем порядке: ближе к старту находятся белки большой молекулярной массы, порядка 120—150 кДа, а к финишу далее всех продвинулись протеины массой 5—10 кДа.

На втором этапе гелевую пластину накладывают на лист нитроцеллюлозы и помещают эту конструкцию между электродами источника постоянного тока (рис. 21.26). Под действием электрического поля белки перетекают из пористого геля на более плотную мембрану, где достаточно прочно закрепляются.

Полученный блот обрабатывается блокирующим раствором, содержащим индифферентные в антигенном отношении белки и/или неионные детергенты (Твин 20), которые блокируют на мембране свободные от антигена места. Затем лист-мембрану разрезают на узкие полоски таким образом, чтобы каждая полоска содержала все антигенные фракции. Описанные этапы выполняются фирмой-производителем.

В результате последовательного проведения иммунных и ферментативной реакции при наличии в исследуемой пробе антител к белкам патогена на блоте появляются темные поперечные полоски, расположение которых находится в зоне определенных белков патогена. Каждая такая полоса свидетельствует о наличии специфических антител к соответствующему антигену. Результат исследования, проведенного методом иммунного блотинга, выдается в виде перечисления антител к конкретным белкам патогена. Например: «выявлены антитела к белкам р17 и р24».

Нитроцеллюлозные блоты после проявления могут долго храниться в высушенном виде. Однако интенсивность окраски при этом значительно ослабевает. Влажные блоты можно фотографировать или с помощью сканеров вводить их графическое изображение в память персональных компьютеров. Специальные компьютерные программы позволяют обрабатывать полученные результаты и оперативно отслеживать динамику спектра антител при динамическом наблюдении.

Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции.

Клеточный ИФА. ELISpot. Поляризационный флуороиммуноанализ (ПФИА).

Клеточный ИФА.

В роли антигена выступает целая клетка. Используется, например, в диагностике уреаплазмоза.

Проходит все стадии ИФА.

Антгены и иммуногены. Антигенные детерминанты, эпитопы. Гаптены.

Антиген -это агент, способный вызвать реакцию иммунной системы и специфично взаимодействовать (связываться) с продуктами этой реакции.

Фактически, чтобы признать какое-либо вещество антигеном, необходимо подтвердить наличие у него трех основных свойств: иммуногенности, антигенности и специфичности. Поскольку каждый конкретный организм иммунотолерантен по отношению к собственным антигенам, т. е. в норме (без патологии) не отвечает на свои обладающие тремя выше указанными свойствами молекулы, приходится добавлять четвертое - чужеродность.

Иммуногенность-способность вызвать иммунный ответ при введении во внутреннюю среду другого организма, обладающего не имеющей дефектов иммунной системой. Антигенность-способность вступать во взаимодействие с продуктами вызванного именно этим веществом иммунного ответа. Специфичность-каждый антиген вызывает свой иммунный ответ и это подтверждается тем, что взаимодействия с продуктами вызванного другим антигеном иммунного ответа, как правило, не наблюдается.(Так называемые перекрестные реакции между антигенами и продуктами различных иммунных ответов все-таки возможны, но в тех случаях, когда антиген поливалентен и у него имеются антигенные детерминанты, совпадающие с таковыми других антигенов).

Вещества, обладающие всеми четырьмя свойствами, принято назы­вать полными антигенами. было обнаружено, что некото­рые вещества обладают антигенностью, но лишены иммуногенности.

Оказывается, что ряд низкомо­лекулярных органических веществ (например, производных фенола или бензола) при введении в организм в чистом виде не вызывают продук­цию антител, но смеси таких веществ с молекулами белка иммунный от­вет вызывают. Анализ антител, образовавшихся в ходе такого иммунного ответа, показывает, что они разделяются по специфичности на две груп­пы: одни из них реагируют только с белком, другие - только с низкомо­лекулярным веществом. Такие вещества получили название неполных антигенов или гаптенов, а используемый в смеси полипетид - белка-носителя.

Обладающая антигенными свойствами молекула должна иметь поверхностные, доступные для взаимодействия с антителами или рецепторами иммунокомпетентных клеток участки. Эти участки-антигенные детерминанты, а их наружная поверхность, способная обеспечивать слабые химические взаимодейст­вия с соответствующим участком антитела или рецептора клетки-эпитоп. Количество антигенных детерминант принято называть ва­лентностью антигена, а сами антигены в зависимости от этого свойства разделять на моновалентные, поли- и мультивалентные. антигенные детерминанты одной молекулы могут быть разными (поливалентность), или одна и та же антигенная детерминанта может по­вторяться несколько раз, как это характерно для полимеров регулярного строения (мультивалентность).

Антигенные детерминанты должны постоянно сохранять свою пространственную структуру. антигенные свойства в наибольшей мере зависимы от химической структуры вещества.

По структурной организации антигенов их принято делить на две группы: так называемые растворимые антигены и корпускулярные (партикулированные) антигены. В первую группу входят все антигены, представленные собственно молекулами, причем любой сложности. Вторую составляют состоящие из множества различных молекул иммуногенные агенты (фрагменты клеток или вирусов, не разрушенные вирусные частицы или клетки микроорганизмов, клетки других высших организмов).

В микробиологии появился и используется еще один термин - слож­ные антигены, близкий по смыслу к термину «корпускулярные антиге­ны». Так принято называть бактерии или вирусные частицы, речь идет не об одном антигене, а об их совокупности. В частности, для описания антигенных свойств бак­терий как сложных антигенов, приходится применять так называемые антигенные формулы - символические отображения сочетаний наибо­лее важных для идентификации штаммов антигенов. Выявляемые с по­мощью антител отличия бактерий разных видов и штаммов могут быть связаны с компонентами капсул, клеточных стенок или жгутиков. Кап­сульные антигены в микробиологии принято обозначать латинской бу­квой К, антигены клеточных стенок (так называемые соматические ан­тигены) - буквой О, жгутиковые - буквой Н. В формуле указывается, какой именно антиген из каждой группы имеется у бактерий данного штамма, символ группы отделяется от следующего двоеточием, напри­мер, О111: К58: Н2. Фактически антигенная формула является характе­ристикой внутривидового варианта, определяемого с помощью специфи­ческих сывороток, поэтому такие варианты называют сероварами (от лат. serum - сыворотка). На равных с этим термином могут использо­ваться термины серогруппа и серотип. Достаточно провес­ти реакции агглютинации с определенными сыворотками, чтобы получить сведения об особенностях выделенного штамма. Такой прием называется серотипирование и широко применяется в медицинской микробиологии.

Агенты, вызывающие после первичного попадания в организм отсутствие реакции иммунной системы на последующие контакты организма с ними (толерантность), называют толерогенами. Агенты с противоположным действием, т. е. вызывающие повышенную реактивность организма на вторичные попадания, чаще всего называют аллергенами.

В случае необходимости подчеркнуть характер развивающегося в организме ответа на антиген применяют термины тимусзависимые и тимуснезависимые антигены, указывая на участие или неучастие в иммунном ответе Т-лимфоцитов.

трансплантационные антигены. под этим термином фактически понимают располагающиеся на поверхности клеток белки главного комплекса гистосовместимости (МНС). Наличие таких антигенов позволяет отличать один организм от другого (за исключением однояйцевых близнецов) даже в пределах одной семьи, т. е. они определяют индивидуальную антигенную специфичность.

В современной биологии и медицине широкое распространение полу­чил термин дифференцировочные антигены или CD-антигены. Так называют поверхностные молекулы клеток, по которым с помощью соответствующих антител можно отли­чать клетки определенной группы или же клетки одной и той же группы, находящиеся на разных стадиях развития или активации.

 

2. Применяя закон действующих масс, можно определять константу равновесия такой реакции по формуле К = [АтАг] / [Ат] · [Аг], где [АтАг] – концентрация комплексов антиген-антитело, [Ат] – концентрация свободных от антигена антигенсвязывающих участков, [Аг] – концентрация несвязавшихся антигенных детерминант. Значение рассчитанной по такой формуле константы является количественным выражением силы (прочности) связывания одного парапота с одним эпитопом. Эту силу называют сродством, или аффинностью (аффинитетом).

Учитывая, что обычное антитело имеет два антигенсвязывающих уча-стка и антиген может иметь несколько повторяющихся антигенных детерминант, общую силу связывания всего антигена с антителом приходится выражать таким понятием, как авидность. Следует помнить, что реально аффинность антител можно определить только при использовании моновалентных антигенов, чаще всего гаптенов. Поэтому для характеристики содержащих антитела суспензий или сывороток чаще применяется термин «авидность».

 

Гены легких цепей каппа человека:

1.гены легких цепей типа каппа расположены в хромосоме 2 2) Vκ генов около 250, Jκ генов – 5, Сκ ген – 1 3) две определяющих комплементарность области (complementarity deter-ming region, сокр. CDR) вариабельного домена входят в состав V-сегмен- та, одна – J-сегмента, отсюда возможное количество κ-цепей, различаю- щихся по специфичности в отношении эпитопов антигенов 250 x 5 =1250 4) аминокислотные остатки с 1 по 95 кодируются V–сегментом, с 96 по 106 – J–сегментом, со 107 по 217 – С–геном.

Гены тяжелых цепей. V, J, C, D.

При формировании функционального гена тяжелой цепи происходит не одна, а несколько перестроек на уровне ДНК. Сначала происходит объединение случайно выбранных генов D и J (ил. 39). При этом все на-ходящиеся между ними сегменты ДНК делетируются. Затем осуществляется второй акт рекомбинации, приводящей к объединению комбинации DJ с одним из случайно выбранных V-генов, и снова между ними расположенные фрагменты ДНК снова удаляются.

 

специфичность уже сформированного антитела к антигену не меняется даже после осаждения антител из раствора ионами солей или органическими растворителями. Исходя из этого, можно полагать, что взаиморасположение легких и тяжелых субъединиц иммуноглобулина является максимально стабильным, вероятно, вследствие структуры не только вариабельных, но константных доменов.

Неадсорбированные сыворотки обладают высокими титрами антител, но способны давать групповые (перекрестные) реакции.

На скорость образования антител (АТ) влияет ряд факторов: доза Аг (сила Аг-воздействия), частота Аг-стимуляции и состояние иммунной системы индивида (то есть его иммунный статус). Если организм впервые встречается с Аг, то развивается первичный иммунный ответ, а при повторном контакте — вторичный ответ (рис. 10-11).

Первичный иммунный ответ

Появлению антител (АТ) предшествует латентный период продолжительностью 3~5 сут. В это время происходит распознавание Аг и образование клонов плазматических клеток. Затем наступает логарифмическая фаза, соответствующая поступлению антител (АТ) в кровь; её продолжительность — 7-15 сут. Постепенно титры антител (АТ) достигают пика и наступает стационарная фаза, продолжительностью 15-30 сут. Её сменяет фаза снижения титров AT, длящаяся 1-6 мес. В основу пролиферации клеток-продуцентов AT заложен принцип селекции. В динамике антителообразования титры высокоафф