Создание клонотек пептидов методом фагового дисплея

Метод фагового дисплея представляет собой простую и эффективную систему отбора белков и пептидов с требуемыми свойствами, экспрессированных на поверхности частиц нитевидных бактериофагов. Данный метод обеспечивает прослеживание прямой зависимости между фенотипом и генотипом. Разработан эффективный метод наработки коротких пептидов, экспрессирующихся на поверхности бактериофагов в составе их собственных структурных белков. Фаг, несущий рекомбинантную ДНК, внедряется в бактериальную клетку (E.coli), где происходит его амплификация. Таким образом создаются библиотеки, содержащие миллионы фагов, каждый из которых содержит в своем капсиде уникальный пептид.

Для конструирования клонотеки пептидов используют основной (pVIII) и минорный (pIII) белки оболочки нитевидного фага. Зрелые белки встраиваются в оболочку бактериофага в процессе ее сборки. Пептидные эпитопы связываются с N-концевыми последовательностями зрелых белков или на небольшом от них расстоянии. Поскольку концевые последовательности большинства белков, как правило, экспрессируются на поверхности глобулы, то интегрируемые пептиды не нарушают основных свойств белков pVIII и pIII, а также оказываются доступными для их распознавания извне

In vitro и in vivo скрининг библиотек фагового дисплея

Процесс распознавания пептидов называется in vitro селекцией, в ходе которой производят скрининг фаговых библиотек путем взаимодействия экспонированных на поверхности фагов белков с определенным иммобилизованным лигандом.

Для того чтобы выделить из клонотеки пептиды с искомой биологической активностью, применяют различные методы скрининга. Для выделения пептидов, имитирующих определенные эпитопы, используют биотинилированные моноклональные антитела (mAB) соответствующей специфичности, которые иммобилизуют на твердой подложке с помощью стрептавидина.

Фаговые частицы, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие эпитопы, связываются с антителами и задерживаются подложкой, тогда как другие фаговые частицы удаляются в процессе промывания. Задержанные на подложке фаговые частицы элюируют буфером с низким значением рН, индивидуальные клоны дополнительно размножают в бактриальных клетках, и экспрессированные на их поверхности эпитопы исследуют по различным критериям.

Многие высокодифференцированные ткани организма утрачивают свои специфические свойства в условиях культивирования in vitro. Поэтому отбор требуемых пептидов фагового дисплея осуществляют in vivo.

В этом случае суспензию фаговых частиц дисплея вводят в кровоток экспериментального животного, через некоторое время из исследуемого органа животного выделяют находящиеся там фаговые частицы. Выделенные фаги размножают в бактериальных клетках и проводят новый раунд отбора, в результате чего удается выделять фаговые частицы, специфически задерживаемые данным органом, а следовательно, экспрессирующие на своей поверхности лиганды, специфичные в отношении рецепторов органа.

Отбор in vivo пептидов и белков, экспрессирующихся в фаговом дисплее, может быть применен и для разработки новых лигандов белковой природы, специфичных в отношении других тканей, в том числе опухолевых, что может быть использовано для лечения соответствующих заболеваний.

Фаговый дисплей антител

Первыми белковыми молекулами, успешно «представленными» на поверхности нитевидных бактериофагов, были иммуноглобулины, а точнее их антигензсвязывающие фрагменты (scFv или Fab). Обычно после процедуры выделения и очистки Fab-фрагменты являются более стабильными по сравнению с scFv-фрагментами антител. Также из Fab-фрагментов сравнительно легко можно получить полноразмерные иммуноглобулины. Для этого к С-концевой части С_Н1-домена присоединяют Fc-фрагмент.

Технология фагового дисплея антител происходит следующим образом. В фагмиде (pCES1) конструируют ген, в котором последовательность, кодирующая вариабельный и первый константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H и С_Н1), объединяют в правильной рамке трансляциии с геном III нитевидного фага fd.

Вторая, дополняющая цепь Fab-фрагмента, состоящая из вариабельного и первого константного домена легкой цепи иммуноглобулина (V_L и С_L), экспрессируется отдельно. Сигнальная последовательность (S) направляет экспрессированные белки в периплазму бактериальной клетки. После секреции в периплазматическое пространство клетки обе цепи ассоциируют и образуют активный Fab-фрагмент иммуноглобулина.

 

14. Проблема решается с помощью метода «гуманизации» мышиных антител. Суть метода заключается в создании генетических структур, которые объединяют V-гены мышиных моноклональных антител и С-гены иммуноглобулина человека необходимого изотипа. В результате специфичность образующихся гибридных антител определяются генами мыши, а их антигенные свойства — преимущественно генами человека. Более сложный, но радикальный способ заключается в объединении гипервариабельных частей V-генов мыши с человеческими С-генами и генами, кодирующими каркасную последовательность V-гена.Методы «гуманизации» моноклональных антител открывают перспективу получения больших объемов моноклональных антител, которые могут использоваться для иммунотерапии самых разнообразных патологических состояний у человека.

Фьюжин-белки используют для иммунизации и для того чтобы а/т не деградировало в организме (пришивают БСА) и т.о. увеличивается продолжительность жизни а\т.

ПЕГ-антитела –полиэтиленгликоль пришивается к молекулам на свободные хвосты, расчепляющиеся протеазами крови,и фермент не могут сесть на свое место и а/т будет циркулировать. (сывороточный альбумин).