Мка получают с помощью гибридомной технологии, А пка выделяют из сыворотки.

ПКА продуцируются большим количеством клонов В-клеток, полиспецифичны, высокая кросс-реактивность, распознают несколько эпитопов на поверхности, гетерогенны по специфичности, афинности, изотипу. Сродство к а/г описывается понятием авидность, получаем ограниченное количество, поликлоны уникальны, нестандартны, хороши для визуальных тестов, каждая сыворотка уникальна по составу а/т, получение дешевле, быстрее получить, более важна чистота а/г.

МКА продуцир. 1 В-клеточный клон, моноспецифичны, распознают 1 детерминанту на пов-ти а/г, гомогенны, афинность, стандартны, имеют постоянные свойства, берут в более чувствительные, более специф., воспроизводимые тесты, дороже, медленнее получаются.

Поликлональные антитела - антитела, которые образуются в сыворотке (антисыворотке) крови в разных линиях B-клеток и связываются с разными антигенными детерминантами (эпитопмы) молекулы-мишени (антигену).

Смесь антител выделенную из сыворотки крови называют поликлональным препаратом. Поликлональные антитела раньше широко использовались в иммунодиагностике, для их получения использовалася иммунизированное животное (обычно кролик). Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для некоторых методов диагностики:- содержимое отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой;- поликлональни антитела нельзя применять, если необходимо различить две подобных мишени, то есть когда патогенная (мишень) и непатогенная формы различаются единственной детерминантой.

МКА применяюстя в биотехнологии, при лечении и диагностики болезней. Основные области применения моноклональных антител в настоящее время — (1) подавление иммунитета (иммуносупрессия) при аутоиммунном заболевании и при трансплантации органов, (2) лечение рака. При иммуносупрессии целью моноклональных антител будут рецепторы на поверхности лимфоцитов, а при раке — рецепторы, характерные для раковых клеток.

Методы получения антител

ПКА – из крови иммунизированного животного.

МКА – гибридомная технология. Из иммунизированного животного (мыши) извлекают селезенку, получают В-клетки. Отдельно растят мутантные плазмоцитомы, чувтвительные к ГАТ-среде (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Слияние В-клеток (берут в 2-кратном избытке) с плазмоцитомами – с помощью ПЭГ или электропорации. Полученные гибриды помещают на ГАТ-среду – растут только гибридомы – В-клетка+плазмоцитома. Сформировавшиеся клоны проверяют на способность продуцировать антитела и отбирают те из них, которые дают антитела к использованному для иммунизации животного антигену. Часть клеток из каждого такого клона консервируют путем замораживания при температуре жидкого азота, а сам клон подвергают расчистке. Суть расчистки заключается в разделении клона на изолированные клетки, получении их потомства и анализе этого потомства на однородность и продукцию атител. При необходимости проводят несколько последовательных расчисток. На каждом этапе расчистки часть клеток каждого клона также консервируют, чтобы в случаях гибели клона была возможность не повторять процедуру с начала, а продолжить ее с конкретного этапа. Полученные стабильные, не дающие расщепления клоны являются источниками гибридом, пригодных для получения абсолютно однородных по специфичности и изотипу антител, которые и называют монокло-нальными. Наработку нужного количества антител осуществляют либо побуждая гибридомные клетки к продукции антител в культуре, либо вводя суспензию таких гибридом в организм специально подготовлен-ных лабораторных животных.

РАТ (рекомбинантные АТ) создаются на основе известных последовательностей генов АТ. Получены с использованием технологий молекулярной биологии и генной инженерии. Клонируются гены, сегменты иммуноглобулинов – получают генный репертуар. Получают новые конструкции. Селекция. Для получения РАТ используют вирусы (обычно фаги – фаговые библиотеки), бактерии и дрожжи (для клонирования генов; в дрожжах и др.эукариотических клетках происходит гликозилирование иммуноглобулинов, у прокариот не осуществляется). Получают различные типы РАТ: замещенные, минимальные (Vдомены, Fv-фрагменты, sc-Fv, минимальные узнающие пептиды, иммуноадгезины, абзимы)

 

Стадии получения МКА и ПКА

1) Выбор подходов и средств к иммунизации

· Тип АТ (ПКА, МКА) в зависимости от поставленной цели, для которой будут использованы АТ, и теста, в котором они будут применяться

· Выбор животного, продуцирующего АТ (по размеру – в зависимости от типа получаемых АТ – ПКА или МКА, и необходимого количества АТ. Животное должно быть филогенетически удалено от АГ. Выбирают не только по виду, но и специфические линии. Животные должны быть стерильны, т.е. не инфицированы. Как правило, используют самок, т.к. у них лучше выражен иммунный ответ, особенно в период полового созревания. Используют молодых животных)

· Выбор типа АГ (иммуногена)

· Выбор носителя для гаптена (Носитель должен быть филогенетически удален от иммунизируемого животного, имеет много антигенных детерминант, т.е. и сам является хорошим антигеном и иммуногеном)

2) Подготовка иммуногена

· Определение эпитопов АГ (с помощью специальных программ, тестов)

· Выделение и очистка АГ – для натуральных, естественных, или синтез пептида/гаптена – для искусственных. Антиген должен быть чистым, без примесей, стерильным (фильтрование через поры диаметром 0,22 мкм). Если синтетический пептид, то в нем не должно быть обширных гидрофобных областей, длинных повторов одной а/к (сер, тре, вал), не должен начинаться и заканчиваться на глу, про, асп.

· Сшивка с носителем. Сшивка с носителем химически – с помощью кросс-линкеров. Различные кросс-линкеры используют для сшивки различные группы. Если в качестве АГ используется небольшой пептид, то можно сшить между собой 2 его молекулы с помощью глутарового альдегида. Есть специфические кросс-линкеры, сшивающие аминогруппу одного белка и сульфидную группу другого, т.е. обеспечивают пришивание в определенном положении (сульфо-MSB). Различные кросс-линкеры необходимы для того, чтобы не получить антитела на сам кросс-линкер.

· Контроль качества, стерильности (высевом), токсичности (на культуре клеток). Необходимо убедиться, что АГ свободен от липополисахаридов бактерий, полиакриамидного геля, додецилсульфата натрия, мочевины, других органических примесей, чтобы рН не был экстремальным – если надо, то забуферить.

3) Иммунизация

· Доза

· Периодичность инъекций

· Количество инъекций

· Способ инъекций

· Контроль (отбор проб, титры)

АГ вводится в 2-3-4 приема с интервалами не менее 20 дней (учитывая схему развития иммунного ответа).

Первая инъекция – премирующая – самая высокая доза АГ, используется полный адъювант Фрейнда. Следующие инъекции – бустирующие (поддерживающие) – уменьшается доза, используется неполный адъювант Фрейнда. Перед забором крови для приготовления сыворотки или перед забором селезенки последние терминальные инъекции делаются с интервалом в 1 день, но минимальной дозой.

Способ инъекции зависит от типа АТ (ПКА или МКА). Для МКА – в перитониум, ближе к селезенке (интраперитониально). Для ПКА – подкожно (у кроликов – в лопатку, бедро).

Забор крови для определения титра АТ у кроликов и мышей – из уха.

4) ПКА – забор крови для приготовления сыворотки. У кролика – из уха, у мыши – из хвоста.

МКА – забор селезенки, гибридомная технология.

5) Очистка АТ

ПКА – аффинная хроматография, истощение сыворотки.

МКА – хроматография, высаливание.

6) Контроль качества АТ

· Определение концентрации или титра АТ

· Выявление кросс-реактивности

· Определение изотипа. С помощью ИФА. Получают АТ к различным типам тяжелых и легких цепей. Изотип записывают в паспорт АТ.

· Обычно для МКА эпитопная характеристика – метод взаимодействия с перекрывающимися пептидами.

7) Модификация АТ (метка) осуществляется с помощью кросс-линкеров. Метки: радиоактивные, ферменты, биотин.

8) Хранение

Лиофилизация (высушивание из замороженного состояния) – наилучший способ хранения белка.

Замораживание (-20, -40; -80 – лучшее, т.к. при -80 не действуют протеазы). Модифицированные АТ при замораживании – размораживании могут терять метку, поэтому их хранят при глубоком замораживании с криопротектором.

8. иммунизация. Прививание – в основном 3 раза. BCG. а/г вводиться в 2-3-4 приема с интервалами не менее 20 дней(учитывая схему развития иммунного ответа; чтобы после первого введения развился максимальный, потом сошел на нет).

Подготовка иммуногена. А/г не должен содержать примесей. Рекомбинантные белки- полученные введением чужеродных генов в клетку продуцента. Должен быть стерильным. Белок не должен денатурировать. Эпитоп определили. Необходимо пришить а/г на носитель. Пришивается гаптен химически – кросслинкеры.

Контроль качества, стерильности(высевом), токсичности(на к-ре клеток).

9 требования к свойствам моноклональных антител:

1) Гомогенны,2)стерильны,3) кроссреактивность не должна проявляться.