Химическая природа дегидрогеназ. НАД- и флавин-зависимые дегидрогеназы, их важнейщие субстраты.

Флавиновые дегидрогеназы. составляют другую группу дегидрогеназ. Коферменгами для них являются флавинадениндидаклеотид (ФАД) или флавиномононуклеотид ГФМН) Эти коферменты являются производными рибофлавина (витамгна В2) Рибофлавин содержит циклическую группировку и остаток пятитомного спирта рибитола. ФМН представляет совой рибофлавин-5¹-фосфат, а ФАД, кроме того, содержит остаток адениловой кислоты

Флавиновые коферменты прочно связаны с апоферментамн, следовательно, флавиновые дегидрогеназы это сложные белки. В ходе реакции отщепляемые от субстрата атомы водорода присоединяются к изоаллоксазиновой группировке кофермента

К флавиновым ферментам, содержащим ФМН, принадлежит НАД-Н-дегидрогеназа, которая окисляет НАД-Н. Акцептором водорода в этой реакции служит кофермеит Q (убихинон), который в клетке может существовать в окисленной (убихинон Q) и восстановленной формах (убихинол QH2) НАД-Н-Дегидрогеназа переносит водород с НАД-Н на убихинон

НАД-Н+1 №- + Q -> НАД+ + QH2

При этом атомы водорода сначала присоединяются к ФМН в составе НАД-Н-дегидрогенязы (первая полуреакдия), а затем передаются на убихинон (вторая полуреакция)

Дегидрогеяюы содержащие ФАД, катализируют отщепление водорода от групп -CH2-CH2- с образованием двойной связи.

Окислительное фосфорилирование в цепи дыхательных ферментов, его механизм по Митчелу. Коэффициент Р/О. Разобщение окисления и фосфорилирования. Окислительное фосфорилирование на уровне субстрата, его значение для клетки.

при переносе пары электронов с НАДН+Н+ на атом кислорода синтезируется максимум 3 молекулы АТФ. Приняв во внимание, что для образования 1 моля пирофосфатных связей АТФ в реакции ее синтеза из АДФ и неорганического фосфата необходимо 7,3 ккал энергии, мы можем рассчитать что из 53 ккал свободной энергии, выделяющейся при окислении 1 моля НАДН+Н+, в клетке аккумулируется примерно 22 ккал.т.е. около 40%. Мерой эффективности процесса окислительного фосфорилирования в цепи дыхательных ферментов служит коэффициент Р/О; количество атомов фосфора, включенных из неорганического фосфата в состав АТФ, в расчете на 1 связанный атом кислорода, пошедший на образование воды в ходе работы дыхательной цепи. При окислении НАДН+Н+ он равен 3, при окислении ФАДН2(КоQН2) он составляет 2 и при окислении восстановленного цитохрома С он равен 1.

Существует множество теорий аккумуляции энергии. Наиболее обоснованной на настоящий момент является химиоосмотическая концепция сопряжения, выдвинутая Митчелом. Суть химиоосмотической концепции сопряжения в следующем: свободная энергия, выделяющаяся при движении электронов по цепи дыхательных ферментов, используется для откачки протонов «Н+» из внутреннего пространства, т.е. матрикса митохондрий через внутреннюю мембрану митохондрий в межмембранное пространство. В результате в межмембранном пространстве митохондрий накапливаются протоны, а в матриксе митохондрий накапливаются гидроксилы, т.е. «ОН». Перемещение «Н+» из внутреннего пространства митохондрий в окружающую среду осуществляется за счет анизотропного расположения в мембране митохондрий ферментных комплексов, причем на уровне каждого из 3 комплексов главной дыхательной цепи при прохождении через него пары электронов из внутреннего пространства митохондрий в межмембранное пространство выбрасывается два протона. Сама же внутренняя мембранна непроницаема для протонов.В результате откачки протонов из матрикса митохондрий в мемжмебранное пространство создается разность электрохимических потенциалов относительно внутренней мембраны митохондрий. Она складывается из градиента концентрации протонов относительно внутренней митохондриальной мембраны;снаружи концентрация протонов выше, чем изнутри, и разности электрического заряда относительно этой мембраны с наружной стороны мембраны заряд положительный, тогда как изнутри отрицательный.

Система, имеющая в своей структуре градиент электрохимического потенциала, является системой, имеющей запас химической энергии. Эта химическая энергия используется в дальнейшем для синтеза АТФ. Трансформация энергии электрохимического градиента в энергию макроэргических связей АТФ осуществляется в ходе работы надмолекулярного белкового комплекса, являющегося структурным компонентом внутренней митохондриальной мембранны. Этот комплекс состоит из двух субъединиц: F0 и F1. Субъединица FО пронизывает внутреннюю митохондриальную мембрану, образуя туннель, через который протоны могут двигаться по градиенту концентрации из межмембранного пространства в матрикс митохондрии. Субъединица F1, состоящая из нескольких полипептидных цепей, прикреплена к субъединице Fo c внутренней стороны мембранны и представляет собой фермент АТФсинтетазу, способную использовать свободную энергию, выделяющуюся при движении протонов по градиенту электрохимического потенциала, для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата.

Таким образом, по Митчелу аккумулирование свободной энергии, выделяющейся в ходе работы цепи дыхательных ферментов, состоит из двух этапов: на первом этапе энергия, выделяющаяся при движении электронов по дыхательной цепи, трансформируется в энергию электрохимического градиента, а на втором этапе энергия электрохимического градиента трансформируется в энергию макроэргических связей АТФ. Примерами окислительного фосфорилирования на уровне субстрата могут служить два далее приведенных превращения:

При окислительном декарбоксилировании 2оксоглутарата в цикле Кребса на первом этапе энергия окисления накапливается, во-первых, в виде энергии восстановленного НАДН+Н+, во-вторых, в виде энергии макроэргической связи продукта окисления сукцинила~КоА. На следующем этапе энергия макроэргической связи сукцинил~КоА трансформируется в энергию макроэргической пирофосфатной связи ГТФ.

Часть процесса окислительного расщепления глюкозы. Промежуточный продукт этого метаболического пути 3фосфоглицериновый альдегид подвергается окислению с образованием 1,3 дифосфоглицериновой кислоты, причем энергия окисления накапливается в виде энергии восстановленного НАДН+Н+ и энергии макроэргической связи окисленного субстрата реакции с остатком фосфорной кислоты. На следующем этапе энергия макроэргической связи 1,3дифосфоглицериновой кислоты опять же трансформируется в энергию макроэргической пирофосфатной связи АТФ.

Разобщение окисления и фосфорилирования.

Нарушение целостности внутренней мембраны митохондрий будет сопровождаться нарушением синтеза АТФ, поскольку разрядка электрохимического градиента будет идти в обход системы синтеза АТФ; в то же время работа ферментных комплексов дыхательной цепи будет продолжаться, другими словами, окисление будет идти, тогда как фосфорилирование будет нарушено, частично или полностью. Такое состояние известно под название разобщения окисления и фосфорилирования. Коэффициент Р/О при этом при окислении НАДН+Н+ становится меньше 3 и может принимать любые значения вплоть до 0. Поскольку в неповрежденных митохондриях скорость окисления лимитируется эффективностью работы сопряженного с ним процесса фосфорилирования, то при разобщении скорость окисления в митохондриях возрастает. К числу соединений, получивших название веществ-разобщителей, относятся полихлорфенолы и нитрофенолы, используемые в сельском хозяйстве для борьбы с вредителями; к ним относится, например, ацетилсалициловая кислота, используемая в медицине в качестве жаропонижающего средства. Разобщающим эффектом обладают также высшие жирные кислоты в высоких концентрациях. В митохондриях бурой жировой ткани обнаружен специфический белок, получивший название «термогенин», выступающий в качестве проводника протонов через внутреннюю мембрану. Вызываемое с его помощью разобщение окисления и фосфорилирования в митохондриях буровой жировой ткани приводит к увеличению теплопродукции этой тканью, что является ее главной физиологической функцией.

Микросомальное окисление. Роль микросомального окисления в организме. Процессы гидроксилирования, участие в нем цитохрома Р450. Значение микросомального окисления в обезвреживании ксенобиотиков и инактивации лекарственных препаратов.

В клетках идут и окислительные процессы, связанные с присоединением кислорода к окисляемым субстратам, иначе говоря, процессы оксигенирования. Эти процессы не сопровождаются аккумуляцией энергии вся выделяющаяся свободная энергия превращается в теплоту. Поэтому вся совокупность окислительных процессов этого типа получила название СВОБОДНОЕ ОКИСЛЕНИЕ. Процессы оксигенирования идут в различных клеточных мембранах: мембранах эндоплазматической сети, мембранах митохондрий и др., но поскольку основное количество реакций оксигенирования идет в мембранах эндоплазматической сети, эти процессы обычно называют не совсем в принципе точным термином процессы микросомального окисления.

В процессах свободного окисления участвуют ферменты из группы оксигеназ: монооксигеназы (гидроксилазы) и диоксигеназы, а также цитохромы типа Цит.b5 или Цит.Р450, т.е. цитохромы, отличные от тех, которые работают в главной цепи дыхательных ферментов.

В ходе процессов микросомального окисления происходит расщепление ряда метаболитов, в том числе идет катаболизм питательных веществ. Так, при участии диоксигеназы идет начальный этап расщепления аминокислоты триптофана, а при участии оксигеназы гомогентизиновой кислоты идет преобразование гомогентизиновой кислоты промежуточного продукта расщепления тирозина в малеилацетоацетат.С помощью диоксигеназ может идти разрыв углерод-углеродных связей и в ациклических соединениях. По такому механизму идет, например, превращение молекулы b-каротина в две молекулы ретиналя.

Реакции окисления, идущие с участием монооксигеназ, иначе реакции гидроксилирования, также участвуют в синтезе многих нужных для организма соединений. Эти реакции могут идти как в эндо плазматической сети, как например, гидроксилирование остатков пролина и лизина при синтезе коллагена в фибробластах соединительной ткани или гидроксилирование дофамина при его превращении в норадреналин в клетках мозгового вещества надпочечников.

Важной функцией микросомального (свободного) окисления является инактивация биологически активных соединений, тем или иным путем поступающими в клетки. Это могут быть как экзогенные токсичные соединения ксенобиотики, так и соединения, образующиеся в самом организме. Подобно рода процессы получили название детоксикации или в более общем виде биотрансформации. Кстати, инактивация многих лекарственных препаратов, являющихся по своей сути типичными ксенобиотиками, идет путем их гидроксилирования. В качестве примера можно привести реакцию гидроксилирования антифебрина:

В ходе подобного рода реакций, во-первых, изменяется структура соединений, в результате чего снижается их токсичность; во-вторых, за счет появления дополнительных полярных группировок в молекуле улучшается их растворимость в воде, тем самым облегчается их выведение из организма; в третьих, появление в структуре соединений гидроксильных группировок облегчает их последующее участие в реакциях коньюгации следующем процессе биотрансформации.

Как известно, в гидроксилазных реакциях параллельно окислению основного соединения субстрата реакции должно окисляться еще одно соединение косубстрат. В качестве косубстратов в различных реакциях могут использоваться НАДН+Н+, НАДФН+Н+, аскорбиновая кислота, 2оксуглутарат и др. Работа гидроксилаз всегда сопряжена с работой цитохромов b5 или Р450. Косубстраты выступают в качестве восстановителей цитохромов, в свою очередь цитохромы выступают в качестве окислителей связывающихся с ними субстратов. В общем виде (самый простой вариант) фукционирование такой системы может быть представлено в следующем виде:

Цитохром Р450 выступает в качестве коллектора электронов, поступающих с окисляемого субстрата и НАДФН+Н+. Далее происходит передача этих электронов на кислород с последующим образованием конечных продуктов: гидроксилированного субстрата и воды. В мембранах эндоплазматической сети присутствует много различных изоферментных форм цитохрома Р450, более того, многие ксенобиотики, в том числе и лекарственные, препараты могут индуцировать синтез этого цитохрома.