Хід визначення за калібрувальним графіком

1. Побудова калібрувального графіка.

З розчинів сульфатної кислоти і суспензії барій сульфату готують ряд розведень, що відповідають одиницям помутніння S–H (табл. 4).

Стандартні розчини змішують у пробірці, струшують і у той же час фотометрують у кюветі з товщиною шару 5 мм проти дистильованої води за довжини хвилі 630 – 670 нм (розд. 2.1.1).

Будують калібрувальний графік в координатах: по осі ординат – екстинкція, по осі абсцис – одиниці помутніння S–H. Складають калібрувальну таблицю (стор. 48).

Таблиця 4

Склад стандартних розчинів

 

№ пробірки Інгредієнти, мл
Стандартна суспензія BaSO4	0,67	1,35	2,7
0,2 н розчин H2SO4	2,33	1,65	0,3
Одиниці помутніння (S–Н)

2. Визначення одиниць помутніння досліджуваної сироватки крові.

У пробірку вносять 3 мл тимолового реактиву, додають 0,05 мл сироватки крові, перемішують, витримують 30 хвилин при кімнатній температурі і фотометрують у кюветі з товщиною шару 5 мм за довжини хвилі 630 – 590 нм проти тимолового реактиву. Ступінь помутніння, що вимірюється в одиницях S–H, знаходять за ка­лібрувальним графіком. Якщо помутніння перевищує 20 одиниць S–H, то варто провести повторне визначення із сироваткою крові, яка розведена фізіологічним розчином (розчин з масовою часткою натрій хлориду 0,9 %) у співвідношенні 1:1, а результат помножити на2.

Норма: 0 – 4 одиниці S–H.

За отриманими даними екстинкції досліджуваної сироватки знаходять ступінь помутніння S–H і роблять клініко-діагностичний висновок (стор. 49).

Примітка. Важливою умовою одержання точних даних з колоїдостійкості білкав крові є відбір крові натще.

Приклад побудови калібрувального графіка

для визначення тимолової проби

Побудований 15.09.2002.

Спеціаліст – Макаренко В.М.

Прилад – колориметр фотоелектричний концентрацій­нийКФК–2; заводський № 8708231.

Кювета – 5 мм.

Довжина хвилі – 640 нм (світлофільтр червоний).

Норма 0 – 4 одиниць S–H.

 

 

За даними калібрувального графіку складається каліб­рувальна таблиця 5.

Таблиця 5

Калібрувальна таблиця

для визначення тимолової проби

Е	0,01	0,02	0,03	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,20
S–Н	0,45	0,90	1,35	1,80	2,70	3,60	4,50	5,40	6,30	7,20	9,00

Клініко-діагностичне значення

Тимолової проби

Тимолова проба є неспецифічною реакцією. Водночас вона набагато більш специфічна для функціонального дослідження печінки, чим інші колоїдно-осадові проби. Вважають, що проба Маклагана позитивна в 90 – 100 % випадків хвороби Боткіна (вже у переджовтяничній її стадії і при безжовтяничній формі), токсичного гепатиту. Реакція позитивна у хворих із постгепатитним і постнекротичним, особливо жовтяничним, цирозом (на відміну від такої у хворих іншими формами цирозів), малярією і вірусними інфекціями. При механічній жовтяниці вона (у 75 % випадках) негативна. Остання обставина має диференційно-діагностичне значення.

У хворих механічною жовтяницею проба стає позитивної лише у випадку, якщо процес ускладнюється паренхіматознимгепатитом.

Тимолову пробу, доповнену тестом визначення уробіліну в сечі, можна використовувати в період диспансерного спостереження за хворими, що лікувались у стаціонарі з приводу хвороби Боткіна.

 

Лабораторна робота № 5

Визначення білкового спектру сироватки крові

Методом електрофорезу на папері

Мета: Вивчити залежність швидкості руху білків в електричному полі від розміру заряду та молекулярної маси, розрахувати кількість білкових фракцій у відносних і абсолютних одиницях, зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 53).

Теоретична частина

Для більш глибокого вивчення білкового спектру крові запропоновані різноманітні засоби електрофоретичного фракціонування. Найбільш широке використання в клінічній практиці одержав зональний електрофорез. Як підтримуюче середовище-носій застосовують папір, ацетат целюлозу, різноманітні гелі та ін. Метод заснований на тому, що під впливом сталого електричного струму білки сироватки крові, що мають електричний заряд, рухаються по просоченому буферним розчином паперу зі швидкістю, що залежить від величини заряду і молекулярної маси частки. При цьому поділ фракцій білків сироватки крові відбувається в напрямку від катоду до аноду. Найбільшу швидкість просування має альбумін, як дрібнодисперсний, з відносно невисокою молекулярною масою білок. За ним слідують глобуліни: a₁ -; a₂ -; b -; g - фракції.

Реактиви та матеріали:

1. Веронал – мединаловий буфер із рН = 8,6.

2. Красильний розчин із водорозчинною синьою сулемою.

3. Розчин з масовою часткою оцтової кислоти 1 %. Розчин для відмивання електрофореграм від барвника, що не зв'язався з білком.

4. Розчин з молярною концентрацією еквівалентів нат­рій гідроксиду 0,01 моль/л. Розчин, що елюює, для витягу бромофеноловогосинього з забарвлених електрофореграм.

5. Освітлюючий розчин, що використовується при розрахунках білкових фракцій.

6. Досліджувана сироватка крові.

Обладнання: апарат для проведення електрофорезу на папері з перетворювачем змінного струму в сталий, з силою струму 50 – 100 мА при напрузі 180 – 400 В, колориметр фотоелектричний концентраційний КФК-2МП.

Хід визначення

1. Готують електрофоретичну камеру. Кювети камери заповнюють на половину об'єму буферним розчином так, щоб рівень рідини був однаковим.

2. Роблять розмітку паперових стрічок для електрофорезу. Потім їх замочують у буферному розчині, залишаючи сухими тільки кінці і вкладають у камеру.

3. Наносять сироватку крові мікропіпеткою ємністю 0,1 мл в об'ємі до 0,02 мл на паперову стрічку в місці лінії старту, що визначається розміткою.

4. Виконують електрофорез. Величина напруги, при якій виконується поділ білкових фракцій, визначається, виходячи з розрахунку 3 – 8 В на 1 см довжини паперової стрічки. Час поділу фракцій складає 3 – 20 годин і визначається експериментальним шляхом.

5. Апарат відключають від мережі, виймають стрічки і розвішують їх на дерев'яних рамках. Рамки просушують у шафі при температурі 100 ^оС протягом 10 хвилин. Висушені стрічки вносять у кювети і заливають барвником на 20 – 30 хвилин. Барвник зливають, а стрічку промивають 1 % розчином оцтової кислоти до знебарвлення ділянок паперу, вільних від білків. Стрічку просушують.

6. Проводять елюцію. Для елюції електрофоретичну стрічку розрізають за кількістю фракцій, орієнтуючись на найсвітлішу ділянку між ними, вносять їх в окремі пробірки і заливають 0,01 н розчином натрій гідроксиду по 3 мл у глобулінові фракції і по 9 мл у пробірку з альбуміновою фракцією. Пробірки струшують і залишають на 30 хвилин, після чого фотометрують за довжини хвилі 500 – 560 нм у кюветі товщиною 10 мм (розд. 2.1.2), причому виміряну величину оптичної густини розчину з альбуміновою фракцією множать на 3. Контролем служить ділянка фореграми, що не містить білка, яка оброблена аналогічно глобуліновій фракції.

7. Розраховують кількість білкових фракцій у відносних (%) і абсолютних (г/л) одиницях та порівнюють отримані дані з нормальним співвідношенням білкових фракцій (табл. 6).