Розрахунок результатів досліджень 


Мы поможем в написании ваших работ!



ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Розрахунок результатів досліджень



 

В роботі з фотометричною апаратурою слід дотримуватись умов вимірювання, що рекомендуються методикою виконання досліджень. Таких умов, як правило, три: товщина робочого шару кювети, довжина світлової хвилі і спосіб розрахунку результатів аналізу. Для вимірювання за допомогою фотоколориметрії застосовують оптичні кювети з товщиною робочого шару 5 мм або 10 мм, рідше 3 мм.

Довжина світлової хвилі, яка зазначається в методиках, визначається фізико-хімічними властивостями розчинів. Візуальними проявами таких властивостей може бути прозорість і забарвлення розчинів.

Якщо в методиці не вказані товщина робочого шару кювети і довжина світлової хвилі, то можливо підібрати їх самостійно. Для вибору довжини світлової хвилі проводять вимірювання на всіх довжинах хвиль, що можливо встановити у приладі. Зупиняються на тій довжині, що дає найбільшу екстинкцію. Чим вище значення екстинкції, тим менше буде ціна однієї позначки шкали екстинкції та величина можливих випадкових помилок в самому процесі вимірювання.

Існують наступні способи розрахунків результатів досліджень в клінічній біохімії: 1) використання умовних одиниць; 2) розрахунки за стандартними (еталонними) розчинами; 3) розрахунки за калібрувальним графіком; 4) розрахунки за коефіцієнтом перерахунку (за фактором).

Умовні одиниці (у.о.) – це примітивний варіант визначення результатів аналізу. Найчастіше це безпосередньо одиниці екстинкції розчинів. В деяких лабораторних методиках екстинкцію, одержану при вимірюванні, множать на 100, 1000 або інший коефіцієнт. Після перетворення отримують показники, які більш зручні для роботи або для порівняння. Використовують умовні одиниці в методиках, що найдавніше використовують у лабораторіях, наприклад, для визначення сіромукоїдів, сіалових кислот, ліпопротеїдів.

Розрахунки результатів досліджень за стандартними (еталонними) розчинами. Стандартні розчини обробляють паралельно з серією досліджуваного біологічного матеріалу в тих же умовах, що й досліджуваний матеріал. Їх використовують в тих випадках, коли мова йде про складні методики, що дають значні похибки. Стандартні розчини нівелюють всі можливі відхилення, але недоліком їх використання є підвищений розхід реактивів і робочого часу, що пов'язано з необхідністю регулярної постановки стандартних проб.

Стандартні розчини мають строго визначену концентрацію певної речовини. Готують їх з реактивів кваліфікації чистоти "х.ч." Зазвичай в біохімічних наборах разом з ре­активами знаходиться і стандартний розчин речовини, що визначають. Наприклад, стандартні розчини є в наборах для визначення глюкози, сечовини, холестерину. Концентрація речовини в стандартному розчині повинна бути близька до фізіологічно нормальних значень відповідного компоненту в біологічних рідинах. Наприклад, концентрація стандартного розчину холестерину 5,2 ммоль/л, що знаходиться в межах фізіологічної норми холестерину в крові.

Розрахунок результатів досліджень, що виконується за стандартними розчинами, проводять за простою арифметичною пропорцією:

Ест – Сст

Ед – Сд Сд = Сст · Едст,

де Ест – екстинкція стандартного розчину, Ед – екстинкція діагностичної проби, Сст – концентрація стандартного розчину, Сд – концентрація діагностичної проби.

Розрахунки результатів досліджень за калібрувальним графіком є зручним варіантом розрахунків, що не потребує зайвих витрат робочого часу та реактивів, як при постановці стандартних проб. Використання калібрувальних графіків доцільно тільки в методиках зі стабільними умовами проведення та добрим підпорядкуванням результатів вимірювання основному закону фотометрії. Калібрувальні графіки будують для кожного фотометру окремо і неприпустимим є їх використання для іншого приладу, навіть у випадку використання однотипних приладів. Періо­дично, звичайно не рідше одного разу на рік, калібрувальні графіки слід перевіряти, а при необхідності – будувати заново.

Будують калібрувальні графіки одноразово при дослід­женні серії калібрувальних розчинів певного складу. Серія складається з 3 – 5 стандартних розчинів, які відрізняються між собою концентрацією у порядку пропорційного збільшення її величини. Діапазон концентрацій повинен охоплювати, як значення фізіологічної норми, так і найбільш імовірні межі патології для досліджуваного компоненту біологічних рідин. З кожного стандартного розчину проби беруть у паралелях для запобігання можливих неточностей піпетування. Для кожної концентрації треба одержати не менше трьох результатів значень екстинкції. Для побудови графіку розраховують середнє арифметичне значення екстинкції. Будують калібрувальний графік на міліметровому папері. Вибирають масштаб значень концентрації й екс-тинкції таким чином, щоб калібрувальна крива проходила під кутом 45о або наближалась до цього значення. Для зручності в роботі на основі калібрувального графіку складається калібрувальна таблиця, де навпроти кожного значення екстинкції вказується відповідна їй концентрація досліджуваного компоненту (лабораторна робота № 4).

Вимоги до оформлення калібрувальних графіків.

1. Вказується точна назва методу дослідження і за­водський номер фотометру, до якого побудовано графік.

2. Вказується довжина світлової хвилі, товщина робочого шару (товщина кювети), вихідні дані для побудови графіку та дата його побудови.

3. Графік підписує спеціаліст, який його виконав.

Розрахунки результатів досліджень за допомогою коефіцієнту перерахунку (фактора перерахунку). Даний варіант розрахунку найбільш простий і швидкий. Розра­хунки виконують за формулою:

Сд = F · Ед,

де Сд – концентрація досліджуваного компоненту, F – коефіцієнт перерахунку, Ед – екстинкція досліджуваної реакційної суміші.

Застосування коефіцієнту перерахунку, як і калібрувального графіка, обмежується методикам з добрим підпорядкуванням результатів вимірювань основному закону фотометрії. Коефіцієнт перерахунку є специфічною величиною для кожного окремого тесту. Як правило, коефіцієнт перерахунку вказується в методиці, але краще його розрахувати самостійно. При цьому враховуються особливості проведення реакції та технічні можливості вимірювальної апаратури лабораторії. Щоб вивести коефіцієнт перерахунку, проводять дослідження стандартних розчинів необхідної речовини у відповідності з методичними вимогами, аналогічними для біологічного матеріалу, або використовують побудований калібрувальний графік. Коефіцієнт перерахунку обчислюють за формулою:

F = .

Коефіцієнти перерахунку вимагають періодичної перевірки, звичайно, не рідше одного разу на рік, при необхідності виводять заново.

Сьогодні актуальність розрахунків даного типу зростає. Це пов'язано з комп'ютеризацією сучасних фотометрів, а також з використанням у роботі КДЛ біохімічних автоаналізаторів. В апаратурі такого рівня коефіцієнт перерахунку вводиться у пам'ять комп'ютера і при вимірюванні екс-тинкції досліджуваного розчину концентрація компоненту розраховується і видається автоматично.

Розрахунки при проведенні кінетичних методів застосовують при дослідженні ферментативної активності біоматеріалу. При їх використанні визначають швидкість ферментативної реакції шляхом серії послідовних вимірювань екстинкції досліджуваної реакційної суміші через однаковий проміжок часу. Аналіз проводять безпосередньо в фотометрі, у термостатованих кюветах, при сталій температурі (37 оС). Розраховують середнє значення зміни екс-тинкції з часом: ΔЕ/Δt. Це співвідношення є характеристикою кінетики ферментативної реакції.

Кінцева формула для розрахунку активності ферменту (А) у кінетичному методі:

А = ,

де R – коефіцієнт, який розраховується з додаткових параметрів, що обумовлені в кожній конкретній методиці (об'єм реакційної суміші, товщина фотометричних кювет, молярний коефіцієнт екстинкції реагенту).


Поляриметр

 

Складовими частинами портативного поляриметра П–161М є: джерело світла 1; світлофільтр 2; поляризатори 3, 4; 5 – трубка з розчином оптично-активної речовини, аналізатор 6; шкала 7; окуляр 8 (рис. 6, рис. 7).

 

1 2 3 4 5 6 7 8

 

       
 
 
   

 


Рис. 6. Схема портативного поляриметра П–161М

 

 

7 5 3 1 4 2 9 6 8

 

Рис. 7. Поляриметр П–161М

1 – дзеркало; 2 – кронштейн; 3 – поляризаційний пристрій; 4 – з’єднувальна трубка; 5 – трубка з розчином оптично-активної речовини; 6 – аналізатор; 7 – лупа відліку; 8 – окуляр; 9 – кільце обертання аналізатора.

Поляризатор і аналізатор (3, 6) – призми Ніколя, що найкраще пропускають світло, яке поляризоване у площині, перпендикулярної до площини головного перетину призми. Звичайно поляризатор складається із двох призм Ніколя. Одна з них показує усе поле зору, що спостерігається через окуляр (8), а друга його половину. Головний перетин цієї призми встановлено під малим кутом стосовно головного перетину великої призми. При обертанні призми навколо оптичної осі приладу змінюється освітленість поля зору. При положенні головного перетину приз­ми аналізатора перпендикулярно до головного перетину великої призми поляризатора ліва половина поля, що відповідає схрещеним призмам, стає темною. Якщо продовжити обертання аналізатора, то затемнюється права сторона поля. Можна домогтися і проміжної освітленості всього поля. Це положення аналізатора вважають нульовим. Невеличкий поворот аналізатора в ту або іншу сторону утворить у полі зору півтінь (звідси і побічна назва поляриметра цього типу – напівтіньовий, рис. 8).

 

 
 

 

 


Рис. 8. Схема напівтіньового поля зору в окулярі

поляриметра

 

Якщо після встановлення нульового положення помістити між поляризатором і аналізатором трубку (5) із розчином оптично-активної речовини, що повертає площину поляризатора на кут α, то з’явиться півтінь. Щоб повернутися до нульового положення, треба повернути аналізатор на такий же кут α, що відраховується ноніусом приладу з точністю до 0,1 за шкалою (7). Джерело світла (1) повинно бути монохроматичним. При використанні білого світла використовують світлофільтр (2 рис. 6), що звичайно є складовою частиною поляриметра.

 

Виміри виконують таким чином:

1. Шляхом переміщення окуляра (8) та освітлювача (1) – лампи потужністю не менше 40 Вт або денного світла, домагаються максимальної і рівномірної освітленості поля зору в окулярі.

2. Нульовий відлік аналізатора визначають із трубкою (5), що заповнена дистильованою водою так, щоб не пот­рапило повітря, бульбашки якого викликають у полі зору появу темних плям. Для цього трубку, тримаючи вертикально, заповнюють так, щоб утворився опуклий меніск, потім обережно збоку насувають сухе покривне скло і наг­винчують притискувальну обойму. Наповнену трубку обтирають ззовні фільтрувальним папером і вміщують у жолобок поляриметра. Обертанням оправ окуляра встановлюють різке зображення лінії поділу поля зору (рис. 8).

3. Обертанням кільця домагаються рівності освітлення лівої і правої частин поля зору.

4. Відлік показань по шкалі ведуть за допомогою но­ніуса. Якщо при однаковій освітленості поля нуль шкали не збігається з нулем ноніуса, то різниця, тобто відлік за шкалою, у цьому випадку являє собою інструментальну поправку αII. Знак поправки вважають позитивним, якщо нуль ноніуса розташований у позитивному напрямку від нуля шкали. Дійсні кути обертання отримують відніманням інструментальної поправки (з її знаком) із отриманих результатів.

5. Наповнюють поляриметричну трубку досліджуваним розчином і вимірюють кут обертання.

Рефрактометр ИРФ–22

Прилад складається з двох частин – корпуса і основи (мал. 6). Всередині корпуса змонтована шкала і регулятор настроювання приладу. До корпуса примикає призмений блок із двох призм – нерухомої (вимірювальної) і рухомої (освітлювальної). Прилад має спеціальну освітлювальну систему – візирний пристрій, який складається із ручки з окуляром і настроювальним механізмом для сполучення межі світлотіні і перехрестя сітки. Через окуляр видна подвійна шкала (у показниках заломлення світла й відсотках вмісту речовини) і поле зору з перехрестям. Поле зору поділено на світлу і темну частини. Межа світлотіні повинна бути чіткою; різкість настроюється за допомогою окуляру. Кольорову аберацію усувають обертанням ручки компенсатора дисперсії.

 

Виміри виконують таким чином:

1. Рознімають призмений блок, піднявши освітлю­вальну призму. Промивають робочі поверхні призм дис­тильованою водою. Підсушують їх тканиною або фільтрувальним папером.

2. На чисту суху поверхню вимірювальної призми наносять краплю дистильованої води й опускають освітлювальну призму до упору. В окулярі візирного пристрою сполучають межу світлотіні з центром перехрестя сітки за допомогою обертання настроювального механізму. На рівні центру перехрестя по лівій шкалі фіксують значення показника заломлення світла (для дистильованої води показник заломлення дорівнює 1,330). Після закінчення виміру піднімають освітлювальну призму і протирають обидві призми фільтрувальним папером.

3. Наносять на поверхню вимірювальної призми краплю рідини досліджуваної речовини і проводять виміри показника заломлення. Після виконання кожного виміру робочі поверхні призм промивають дистильованою водою і просушують.

 

 

6 5в 5г 4 3а 2 1 3б

 

Рис. 9. Рефрактометр ИРФ – 22

1 – корпус; 2 – основа; 3 – призмений блок: а – вимірю­вальна призма, б – освітлювальна призма; 4 – дзеркало; 5 – візирний пристрій: в – окуляр, г – ручка компенсатора дисперсії; 6 – контейнер для запасних частин.



Поделиться:


Последнее изменение этой страницы: 2016-09-20; просмотров: 234; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 44.203.58.132 (0.045 с.)