За реакцією з фосфорно-вольфрамовим реактивом

Мета: Опанувати колориметричний метод визначення сечової кислоти в сироватці крові та зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 73).

Принцип методу: Сечова кислота відновлює фосфорно-вольфрамовий реактив з утворенням комплексу блакит­ного кольору. Інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації сечової кислоти.

Реактиви та матеріали:

1. Розчин сульфатної кислоти з молярною концентрацією еквівалентів 0,7 моль/л, ч.д.а (H₂SO₄). До 200 мл дис­тильованої води додати 10 мл концентрованої H₂SO₄ і довести об'єм до 500 мл.

2. Розчин з масовою часткою натрій вольфрамату двоводного 10 %, ч.д.а (Na₂WO₄ · 2H₂O). Розчиняють 50,0 г Na₂WO₄ · 2H₂O у невеликій кількості дистильованої води, ретельно струшують, доводять водою до 500 мл.

3. Розчин з масовою часткою натрій карбонату 10,3 %, ч.д.а, (Na₂CO₃). Розчиняють 51,5 г Na₂CO₃ у невеликій кількості дистильованої води, доводять водою до 500 мл.

4. Фосфорно-вольфрамовий реактив. У круглодонну колбу місткістю 1,5 л вносять 40,0 г натрій вольфрамату і 300 мл дистильованої води. Додають 32 мл розчину з масовою часткою ортофосфатної кислоти 85 % і декілька скляних бусинок. Обережно кип'ятять протягом 2 годин на пісковій або гліцериновій бані зі зворотним холодильником. Охолоджують до кімнатної температури і доводять дистильованою водою до об'єму 1 л. Додають 32,0 г літій сульфату (Li₂SO₄). Розчин зберігають у холодильнику.

5. Основний стандартний розчин сечової кислоти (1 г/л). Розчиняють 0,6 г літій карбонату (Li₂СO₃) у 150 мл дистильованої води, фільтрують і нагрівають до 60 ^оС. Зважують 1,000 г сечової кислоти, вносять у попередньо нагріту мірну колбу об’ємом 1 л, вливають теплий розчин Li₂СO₃ і швидко струшують. Після розчинення сечової кис­лоти додають 20 мл розчину формаліну, наливають 300 – 350 мл дистильованої води. Додають кілька крапель розчину метилоранжу, потім, струшуючи, повільно додають 20 – 22 мл розчину H₂SO₄ (0,35 моль/л) до зміни кольору у рожевий. Доводять об’єм у колбі дистильованою водою до мітки. Розчин зберігають у холодильнику у склянці з темного скла.

1 мл розчину містить 1 мг сечової кислоти.

6. Робочий стандартний розчин сечової кислоти. 1 мл основного калібрувального розчину доводять до 200 мл дистильованою водою. 1 мл містить 0,005 мг сечової кислоти. Розчин стабільний протягом 2 тижнів при зберіганні у холодильнику.

7. Досліджувана сироватка крові.

Обладнання:

фотометр аналітичний медичний МЕФАН – 8001.

Хід визначення проводять відповідно таблиці 11

(стор. 71).

Перемішують. Через 30 хвилин в кюветі з товщиною шару 10 мм за довжини хвилі 590 – 700 нм (червоний світлофільтр) вимірюють екстинкцію стандартної та досліджуваних проб проти холостої проби (розд. 2.1.4).

Розрахунок концентрації сечової кислоти (С) проводять за формулою:

С = (ммоль/л),

де: Е_досл. – екстинкція досліджуваної проби; Е_ст. – екстинкція стандартної проби; С_ст. – концентрація робочого стандартного розчину у мг в 1 мл (0,5); 10 – перерахунок на сироватку (у досліджувану пробу вносять 0,3 мл, що у 10 разів менше, ніж у стандартну пробу); К – коефіцієнт перерахунку в одиниці СІ мг/100 мл у ммоль/л – 0,059 = 10/168,1 (10 – перерахунок на 1 л сироватки, 168,1 – відносна молекулярна маса сечової кислоти).

Таблиця 11

Вміст робочих розчинів та

хід визначення сечової кислоти

Інгредієнти, мл	Досліджувана проба	Стандартна проба	Холоста проба
Дистильована вода	8,0	–	–
Сироватка крові	1,0	–	–
Розчин H2SO4	0,5	–	–
Розчин Na2WO4 · 2H2O	0,5	–	–
Перемішують, через 5 – 10 хвилин фільтрують через паперовий фільтр у хімічну пробірку
Фільтрат	3,0	–	–
Дистильована вода	–	–	3,0
Робочий стандартний розчин сечової кислоти	–	3,0	–
Розчин Na2CO3	1,5	1,5	1,5
Перемішують
Фосфорно-вольф­рамовий реактив	1,0	1,0	1,0

 

Нормальні величини концентрації сечової кислоти в сироватці крові:

у чоловіків: 0,24 – 0,50 ммоль/л (4,0 – 8,5 мг/100 мл);

у жінок: 0,16 – 0,44 ммоль/л (2,8 – 7,5 мг/100 мл).

Примітки: для розрахунку результатів дослідження сечової кислоти в пробах крові використовують в якості стандартного розчину контрольні сироватки з атестованим вмістом сечової кислоти ("Патосероконт–П–эквин", "Серотрол", "Сермикс" та ін.).

 

Лабораторна робота № 9

Кількісне визначення сечової кислоти в сечі

Мета: Опанувати титриметричний метод визначення сечової кислоти в сечі та зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 73).

Принцип методу: Метод ґрунтується на здатності сечової кислоти відновлювати фосфорно-вольфрамовий реактив, внаслідок чого утворюються оксиди вольфраму нижчої валентності синього кольору, інтенсивність забарв­лення яких пропорційна вмісту сечової кислоти й визначається шляхом титрування червоною кров'яною сіллю. Ця сіль окиснює оксиди вольфраму й синій колір розчину зникає.

Матеріали та реактиви:

1. Фосфорно-вольфрамовий реактив: до 100 г натрій вольфрамату додають 80 мл розчину з масовою часткою ортофосфатної кислоти 85 %, 900 мл води, кип'ятять протягом 2 годин у колбі зі зворотним холодильником і після охолодження доводять об'єм до 1 л.

2. Розчин калій гексоціаноферату (ІІІ) (К₃[Fe(CN)₆]): до 3,292 г К₃[Fe(CN)₆] додають 2 г калій гідроксиду (КОН) і розчиняють у 1 л води.

3. Стандартний розчин сечової кислоти – 0,5 мг у 1 мл: до 0,5 г висушеної сечової кислоти додають 0,5 г літій карбонату (Li₂CO₃), 25 мл води, нагрівають при температурі 50 – 60 ^оС до розчинення, охолоджують і розводять водою до об'єму 1 л.

4. Розчин з масовою часткою натрій карбонату (Na₂CO₃) 20 %.

5. Досліджувана сеча.

 

Хід визначення

До 1,5 мл сечі додають 1 мл фосфорно-вольфрамового реактиву, 1 мл розчину натрій карбонату, перемішують і титрують розчином К₃[Fe(CN)₆] до зникнення синього забарвлення.

Для визначення вмісту сечової кислоти в сечі необхідно знати, яка кількість її відповідає 1 мл К₃[Fe(CN)₆]. Наприклад, на титрування стандартної проби, яка містить 0,25 мг сечової кислоти у 0,5 мл, витрачено 0,34 мл К₃[Fe(CN)₆]. У цьому випадку 1 мл реактиву відповідає 0,73 мг сечової кислоти (0,25: 0,34).

Масу сечової кислоти в сечі за добу (m) вираховують за формулою:

(мг),

де n – кількість сечової кислоти, яка відповідає 1 мл калій гексоціаноферату (ІІІ) (мг/мл); N – об'єм К₃[Fe(CN)₆], який витрачено на титрування проби (мл); д – об'єм сечі за добу (мл); V – об'єм сечі, взятої для аналізу (мл).

У нормі концентрація сечової кислоти у добовій кількості сечі складає 1,6 – 4,8 ммоль/доб (270 – 600 мг).