Розділ 4. Небілкові нітрогенвмісні (Азотисті) сполуки

Фракцію небілкових нітрогенвмісних компонентів крові складають такі речовини як: сечовина, креатин, креатинін, сечова кислота, індикан, амоніак, глутамін, окремі амінокислоти. Ці речовини є продуктами розпаду білків в організмі. Нітроген перерахованих нітрогенвмісних речовин називається залишковим нітрогеном крові (ЗН). 50 % усього ЗН припадає на частку сечовини. Нітроген нітроген­вмісних речовин крові, крім Нітрогену білків і сечовини, називається резидуальним Нітрогеном (РН). У нормі вміст ЗН крові людини коливається в межах 14,2 – 28,5 ммоль/л.

Методи дослідження вмісту сечовини, креатину,

Креатиніну та сечової кислоти в біологічних рідинах

Сечовина (NH₂–CO–NH₂) – синтезується в печінці з амоніаку. Існують такі методи визначення концентрації сечовини: гіпобромітні або газометричні; ксантгідролові; уреазні; діацетилмонооксимні; гіпохлоритні.

Найбільш чутливими і точними методами визначення сечовини є уреазний (ферментативний) і діацетилмонооксимний.

Принцип уреазного методу: сечовина під дією уреази розкладається на вуглекислий газ і амоніак. Амоніак визначають колориметрично по утворенню забарвлених продуктів з реактивом Неслера.

Діацетилмонооксимний метод заснований на реакції взаємодії сечовини та діацетилмонооксиму з утворенням забарвлених продуктів. Метод описаний у теоретичній частині до лабораторної роботи № 6.

Креатин надходить в організм із м'ясом або син­тезується в нирках і печінці. У нормі вміст креатину в сироватці крові складає 76 – 114 мкмоль/л, в сечі креатин відсутній.Підвищені розміри вмістукреатину в сироватці виявляються у хворих із м'язовою дистрофією, не прохід­ністю кишечнику, декомпенсацією серця, нефритом та ін. Поява його в сечі називається креатинурією. Підвищені розміри вмісту креатинувсечі виявляються також при деяких захворюваннях, пов'язаних із порушеннями в обміні креатину (при авітомінозі Е, діабеті, голодуванні), при посиленому розпаді тканин. Паралельне визначення в того самого хворого концентрації креатиніну (абосечовини) у крові та сечі одержали назву – геморенальні проби.

В організмі креатин, з'єднуючись із залишками орто­фосфатної кислоти, утворює креатинфосфат, що є джерелом енергії для м'язових тканин. Наступна дегідратація призводить до утворення креатиніну, похідного креатину і кінцевого продукту його метаболізму. Вміст креатиніну в сироватці крові здорових людей складає 44 – 115 мкмоль/л. У добовій сечі концентрація креатиніну коливається в межах 4,4 – 17,6 ммоль/доб. (0,5 – 2,0 г). Дослід­ження креатиніну широко використовується у клінічній практиці як:

1) один з біохімічних показників гіперазотемій,

2) кліренсовий показник – показник фільтраційної спроможності нирок.

Існує 2 методи дослідження вмісту креатиніну (креатину) у сироватці крові та сечі:

· Колориметричні методи засновані на реакції Яффе і відрізняються між собою за засобом осадження білків плазми або сироватки.

· Ферментативні – засновані на визначенні креатиніну за допомогою ґрунтових бактерій, що розкладають креатинін, або з ферментом – креатинфосфокіназою.

Найбільш точними і специфічними є ферментативні методи дослідження вмісту креатиніну. Проте усі вони складні, їхнє впровадження в клінічну практику потребує великої кількості дорогих реактивів і спеціальної апаратури. Велике поширення одержала реакція Яффе, яка була відкрита у 1886 році. Суть її зводиться до того, що при додаванні до креатиніну кислоти в лужному середовищі з'являється оранжево-червоне забарвлення, обумовлене утворенням таутомеру – пікрата креатиніну.

Сечова кислота синтезується у печінці, як кінцевий продукт обміну пуринових основ. Сечова кислота малорозчинна у воді. У крові міститься у вигляді натрієвої солі, яка зв'язана з білком. Цей комплекс стабілізує сечову кислоту, однак він дуже чутливий до зміни рН середовища. У кислому середовищі зв'язок з білком руйнується і сечова кислота випадає у вигляді кристалів у тканини. У цьому випадку виникає захворювання – подагра.

Багато методів визначення сечової кислоти базуються на відновленні фосфорно-вольфрамової кислоти (реактив Фоліна). Найбільш точним і специфічним методом визначення сечової кислоти є ферментативний метод, в якому використовується фермент уріказа (КФ. 1.7.3.3), що окиснює сечову кислоту.

 

 

Лабораторна робота № 6

Визначення сечовини в сироватці крові та сечі

За кольоровою реакцією з діацетилмонооксимом

Мета: Опанувати уніфікований колориметричний метод визначення сечовини у біологічних рідинах, розрахувати кількість сечовини в сироватці крові та сечі і зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 62).

Принцип методу: Сечовина утворює з діацетилмоно-оксимомпри наявності тіосемікарбазиду і солей феруму в кислому середовищі забарвлені речовини, інтенсивність забарвлення яких пропорційна вмісту сечовини в сироватці крові та сечі.

Прилади та матеріали: фотометр аналітичний медичний МЕФАН–8001, штатив з пробірками, градуйовані піпетки, пробки з алюмінієвою фольгою, реактив № 1 – розчин діацетилмонооксиму і солей феруму, реактив №2 – розчин тіосемікарбазиду і солей феруму, еталон сечовини (16,65 ммоль/л), розчин з масовою часткою трихлораце­татної кислоти 5 %, розчин з масовою часткою H₂SO₄ 10 – 15 %, (або розчин з масовою часткою HCl 25 %), дос­лід­жувана сироватка крові, досліджувана сеча (розводиться перед аналізом у 50 або 100 разів).

Готування робочого реактиву

Ампули з реактивами № 1 і № 2 розкривають під тягою, їхній вмісткількісно переносять у мірну колбу на 100 мл і доводять до мітки дистильованою водою. Перемішують, переливають у посуд і зберігають у холодильнику при температурі 0 – 5 ⁰С.

Еталон сечовини готовий до роботи.

Хід визначення

У хімічних пробірках готують серію розчинів відповідно до таблиці 7.

Таблиця 7

Вміст робочих розчинів

 

Інгредієнти, мл	Проба 1	Проба 2	Еталон	Контроль
Робочий реактив	1,0	1,0	1,0	1,0
Розчин H2SO4	1,0	1,0	1,0	1,0
Сироватка крові	0,01	–	–	–
Розведена сеча		0,01	–	–
Еталон сечовини		–	0,01	–
Дистильована вода		–	–	0,01

 

Пробірки закривають пробками з алюмінієвою фольгою і вміщують у киплячу воду на 10 хвилин. Потім про­бірки охолоджують і по закінченні 15 хвилин вимірюють екстинкцію досліджуваних проб та еталона проти конт­рольного розчину за довжини хвилі 540 нм (зелений світлофільтр). Правила роботи на фотометрі МЕФАН–8001 приведені у розділі 2.1.4.

Розрахунок кількості сечовини в сироватці крові виконують за формулою:

де С – концентрація сечовини, ммоль/л; E_досл. – екстинкціядосліджуваної проби; Е_ст. – екстинкція стандартної проби; – концентрація сечовини в стандартній пробі, 16,65 ммоль/л.

Розраховують кількість сечовини в сечі за цією ж формулою з урахуванням коефіцієнта розведення.

Норма вмісту сечовини в сироватці крові: 2,5 – 8,3 ммоль/л; у сечі: 330 – 580 ммоль/л.

Примітка. Якщо вміст сечовини в крові понад 23 ммоль/л, пробу слід розвести дистильованою водою і провести аналіз повторно. Через нестійкість забарвленого комплексу сечовини з діацетилмонооксимом і залежності кольору від умов нагрівання, калібрувальний графік в цій методиці будувати не рекомендується. При визначенні вмісту сечовини в сечі, починаючи з розміру екстинкції 0,13 – 0,15, потрібно збільшити розведення сечі.