Визначення глюкози в біологічних рідинах

глюкозооксидазним(уніфікованим) методом

Мета: Опанувати кількісний колориметричний глюкозооксидазнийметод визначення глюкози в сироватці крові та за отриманими результатами зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 110).

Принцип методу: Глюкоза у присутності ферменту – глюкозооксидази окиснюється киснем повітря до глюконової кислоти:

 

CH₂OН–(CHOН)₄–СНО+О₂+Н₂О→CH₂OН–(CHOН)₄–СООН+Н₂О₂.

глюкоза глюконова кислота

 

Перекис водню окиснює хромоген, перетворюючи його в забарвлену у синій колір сполуку. Реакція проводиться у термостаті при температурі 37 ⁰С протягом 15 хвилин, потім зупиняється введенням у розчин сульфатної кислоти. Сульфатна кислота перетворює жовте забарвлення у червоне. Стабільність забарвленого комплексу зберігається протягом 1 години.

Прилади та матеріали: колориметр фотоелектричний концентраційний КФК–2, піпетки градуйовані на 5 мл, 1 мл, 0,1 мл, штатив для пробірок та піпеток, досліджувана сироватка крові.

Робота проводиться з використанням готового набору реактивів.

Реактиви: склад набору: суха суміш реактивів (1 флакон), розчин пероксидази в стабілізаторі (1 амп.), розчин хромогену (1 амп.), розчин з масовою часткою цинк сульфату 10 % (10 мл), барій гідроксид (1 г), спиртовий розчин з масовою часткою фенолфталеїну1 % (1 мл), стандартний розчин глюкози 10 ммоль/л (1 амп.);

розчин з масовою часткою сульфатної кислоти 15 % (не комплектується).

 

Готування робочих розчинів

1. Ензимний розчин. У хімічний стакан влити 50 мл фізіологічного розчину, кількісно додати вміст флакону сухої суміші реактивів, додати розчин хромогену, розчин пероксидази, перемішати до повного розчинення кристалів. Відфільтрувати через вату. Зберігати в холодильнику до 10 днів.

2. Розчин з масовою часткою сульфатної кислоти Н₂SO₄ 15 % готується у лабораторії.

3. Стандартний розчин глюкози (з молярною концентрацією глюкози 10 ммоль/л) готовий до роботи.

4. Фізіологічний розчин – розчин з масовою часткою натрій хлориду NaCl 0,9 %.

Хід визначення

Приготувати розчин сироватки у фізіологічному розчині: у хімічну пробірку внести 1 мл фізіологічного розчину, додати 0,05 мл сироватки, перемішати. Подальший аналіз здійснюють за таблицею 18.

 

Таблиця 18

Склад робочих розчинів та хід визначення

 

Інгредієнти, мл	Проба	Еталон	Контроль
Ензимний розчин	1,0	1,0	1,0
Розчин сироватки у фізіологічному розчині	0,50
Стандартний розчин глюкози		0,05
Фізіологічний розчин			0,05
Перемішують і інкубують протягом 15 хвилин при 37 ^0С
Розчин Н2SO4	1,0	1,0	1,0

Перемішують і через 5 хвилин вимірюють екстинкцію за допомогою колориметру фотоелектричного кон­центраційного КФК–2 у кюветах із товщиною шару 5 мм за довжини хвилі 540 нм (зелений світлофільтр). Робота з приладом описана у розділі 2.1.1.

Розрахунок концентрації глюкози у сироватці крові виконують за формулою:

,

де – концентрація глюкози у сироватці крові (ммоль/л); С_ст. – концентрація глюкози у стандартному розчині (10 ммоль/л); – екстинкція досліджуваної проби; – екстинкція стандартної проби.

 

Норма глюкози в крові: 2,77 – 5,55 ммоль/л.

Примітка: якщо концентрація глюкози в крові виявиться 15 ммоль/л, пробу необхідно розвести фізіологічним розчином у 2 рази, провести дослідження і результат помножити на 2.

Лабораторна робота № 19

Кількісне визначення глюкози в сечі за кольоровою реакцією з о-толуїдиновим реактивом

Мета: Опанувати метод кількісного визначення глюкози в сечі та за отриманими даними зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 110).

Принцип методу: Глюкоза при нагріванні з о-толуїдиновим реактивом у розчині оцтової кислоти дає зелене забарвлення, інтенсивність якого пропорційна концентрації глюкози.

Прилади та матеріали: колориметр фотоелектричний концентраційний КФК-2МП, піпетки градуйовані на 2 мл, 1 мл, 0,1 мл, штатив для пробірок та піпеток, досліджувана сеча, калібратор глюкози (27,75 ммоль/л), о-толуїдиновий реактив (склад: о-толуїдин – 6 г, тіосечовина – 0,15 г, оцтова кислота – до 100 мл).

Хід визначення

Спочатку проводять якісну пробу на наявність глюкози (див. лабораторну роботу № 17 – реакція Тромера). У ви­падку позитивної якісної проби на глюкозу, перед проведенням досліду сечу розводять фізіологічним розчином в 2 – 10 разів. Ступінь розведення вказує викладач. Аналіз проводять відповідно до таблиці 19.

 

Всі приготовані розчини нагрівають на киплячій водяній бані 8 хвилин. Охолоджують під водопровідною водою. Фотометрують калібрувальну та досліджувані пробипроти холостої проби за довжини хвилі 590 – 650 нм у кюветі товщиною 5 мм (розд. 2.1.2). Результат множать на ступінь розведення.

Розрахунок кількості глюкози в сечі виконують за
формулою: ,

де – концентрація глюкози в досліджуваній пробі (ммоль/л); А – ступінь розведення сечі, Е_ст. – екстинкція калібрувальної проби; Е_досл. – екстинкція досліджуваної проби; – концентрація глюкози в калібрувальному розчині (27,75 ммоль/л).

Таблиця 19

Вміст робочих розчинів

Інгредієнти, мл	Проби
Дослід-жувана	Каліб- рувальна	Холоста
Калібратор глюкози	–	0,03	–
Фізіологічний розчин	–	–	0,03
Розведена сеча	0,03	–	–
о-толуїдиновий реактив	1,30	1,30	1,30

 

Норма глюкози в сечі: не більше 1,11 ммоль/л.

 

Примітки:

1. При низькому вмісті глюкози готують калібрувальні розчини глюкози з концентраціями 5,55 ммоль/л і 16,65 ммоль/л. Для цього наявний у наборі калібратор розводять відповідною кількістю дистильованої води.

2. Наявність білка в сечі на кількісне визначення глюкози не впливає.

 

Лабораторна робота № 20