Методи вивчення білкового обміну

 

Білки (протеїни) – основна і найбільш важлива структурна і функціональна складова всіх живих організмів. В організмі людини до 45 – 50 % сухої маси припадає на білки. Розрізняють чотири рівні структурної організації білкової молекули: первинний, вторинний, третинний, чет­вертинний.

Білки класифікують на дві групи:

- Протеїни – прості білки, що складаються тільки з залишків амінокислот. Наприклад: альбуміни, глобуліни, протаміни, гістони, проламіни, глутеліни;

- Протеїди – складні білки, молекули яких крім за­лишків амінокислот містять інші компоненти – простетич­ні групи. Наприклад: нуклеопротеїди, хромопротеїди, металопротеїди, глікопротеїди, фосфопротеїди, ліпопротеїди.

Біологічні функції білків: структурна; каталітична; гормональна; транспортна; захисна; механічна; енергетична.

Для діагностики ряду патологічних станів, що супро­воджуються порушеннями в метаболізмі білків, великого значення набули методи визначення загального білка та білкових фракцій (альбумінів; a₁–, a₂–, b–, g– глобулінів та ін.) у біологічних рідинах. Величина вмісту загального білка в сироватці крові дозволяє виявити синдроми гіперпро­теїнемії та гіпопротеїнемії.

Визначення загального білка в сироватці крові й інших біологічних рідинах

Всі відомі засоби визначення концентрації загального білка в сироватці крові та сечі поділяють на такі основні групи.

1. При використанні азотометричних методів виходять із того, що білки містять у середньому 16 % Нітрогену. Отримана при визначенні вмісту білкового Нітрогену величина помножується на коефіцієнт перерахунку.

2. Методи, що базуються на визначенні густини сироватки крові або плазми (метод падаючої краплі) неточні, тому що густина залежить не тільки від вмісту білків, але й інших речовин.

3. При гравіметричному (ваговому) методі білки сироватки крові осаджують, висушують до сталої ваги та зважують. Ці методи трудоємкі і потребують великої кількості сироватки.

4. Рефрактометричний метод визначення концентрації загального білка, який характеризується властивістю середовищ по-різному заломлювати промені світла, також не сучасний, тому що навіть у нормі частина рефракції обумовлюється іншими компонентами сироватки (наприклад, мінеральними речовинами, вуглеводами).

5. З колориметричних методів, які засновані на кольорових реакціях білків з певними реактивами найчастіше застосовується біуретовий метод, який вважається найбільш точним, специфічним і доступним. На біуретову ре­акцію не впливає присутність у крові ароматичних амінокислот (тирозину, триптофану), фенолів, сечової кислоти. Більш чутливий метод Лоурі має істотні недоліки, які обумовлені малою специфічністю та складністю у приготуванні основних робочих розчинів.

Інші колориметричні, нефелометричні, спектрометричні, поляриметричні методи поки не одержали широкого поширення у клінічній лабораторній практиці.

 

Лабораторна робота № 1

Уніфікований метод визначення загального білка в

Сироватці крові. Біуретова реакція

Мета: Дослідити взаємодію білка з лужним розчином купрум (II) сульфату, розрахувати вміст загального білка в досліджуваній сироватці крові.

Теоретична частина

Присутність білка в сироватці крові можна виявити за допомогою ряду кольорових реакцій. Ці реакції властиві складовим частинам білка – амінокислотам або утвореним ними угрупованням. Поліпептиди та білки дають біуретову реакцію, характерну для наявності пептидних зв'язків. Ре­акція чутлива до температури. Підвищення температури збільшує швидкість розвитку забарвлення, тому аналіз необхідно проводити при сталій температурі (звичайно 17 – 20 ⁰С).

Російський вчений Данилевський О.Я., досліджуючи білки та продукти їх гідролізу (1888 р.), помітив, що вони забарвлюються в синьо-фіолетовий колір при додаванні лужного розчину купрум (ІІ) сульфату. Таке саме забарвлення виникало і при додаванні цього розчину до біурету – сполуки, що утворюється при нагріванні сечовини внаслідок відщеплення амоніаку:

 

2H₂N–CO–NH₂ → NH₃ + NH₂–CO–NH–CO–NH₂

сечовина амоніак біурет

 

Данилевський О.Я. вперше висловив припущення, що зв'язок –NH–CO– є з'єднання амінокислот у білковій молекулі. Німецький вчений Фішер Е. у 1902 р. висунув полі­пептидну теорію будови білків, у якій довів наявність зв'язку –NH–CO– між амінокислотами, і назвав цей зв'язок пептидним.

Принцип методу: Білки реагують у лужному середовищі зкупрум (II) сульфатом і утворюють сполуки, які забарвлені у фіолетовий колір. Інтенсивність забарвлення пропорційна вмісту білків у досліджуваному матеріалі.

 

Прилади та матеріали: колориметр фотоелектричний концентраційний КФК-2МП, біуретовий реактив; стан­дартний розчин альбуміну (із людської або бичачої сироватки), досліджувана сироватка крові.

 

Готування розчинів

1. Розчин з масовою часткою калій йодиду 0,5 % у розчині з молярною концентрацією натрій гідроксиду 0,2 моль/л: до 400 мл розчину з молярною концентрацією натрій гідроксиду 0,2 моль/л додають 2 г кристалічного калій йодиду.

2. Біуретовий реактив. 4,5 г сегнетової солі (калій-натрій виннокислий 4-водний) розчиняють у 40 мл розчину з молярною концентрацією натрій гідроксиду 0,2 моль/л. Потім додають 1,5 г купрум (ІІ) сульфату 5-водного (CuSO₄·5H₂O) і 0,5 г калій йодиду. Об'єм доводять до 100 мл розчином з молярною концентрацією натрій гідроксиду 0,2 моль/л. Зберігають у судині з темного скла. Реактив стійкий.

3. Робочий розчин біуретового реактиву. 20 мл біуретовогореактиву змішують із 80 мл розчину з масовою часткою калій йодиду 0,5 % у розчині з молярною концентрацією натрій гідроксиду 0,2 моль/л (відношення 1:4). Розчин стійкий.

4. Стандартний розчин білка – розчин альбуміну (60 г/л).

5. Розчин з масовою часткою натрій хлориду 0,9 % (NaCl): зважують 0,90 г NaCl (х.ч.) і кількісно переносять у мірну колбу на 100 мл, об'єм доводять дистильованою водою до мітки.

а) Хід визначення за стандартним розчином

Готують досліджувані, контрольний та стандартний розчини відповідно таблиці 1.

Таблиця 1

Склад робочих розчинів

 

Реагенти, мл	Проба 1	Проба 2	Контроль	Стандарт
Робочий розчин біуретового реактиву	5,0	5,0	5,0	5,0
Сироватка крові	0,1	0,1	–	–
0,9 % розчин NaCl	–	–	0,1	–
Стандартний розчин альбуміну	–	–	–	0,1

Обережно перемішують, уникаючи появи піни. Витримують 30 хвилин (але не більше 1 години) при кімнатній температурі, потім фотометрують стандартний та дослід­жувані розчини у кюветі з товщиною шару 10 мм за довжини хвилі 540–560 нм (зелений світлофільтр) проти конт­рольного розчину (розд. 2.1.2, 2.2).

Розрахунок загальної кількості білка в сироватці крові виконують заформулою:

,

де: Е_досл. – екстинкція досліджуваної проби; Е_ст. – екстинкція стандартного розчину; С_ст. – концентрація білка в стандартному розчині (60 г/л).

Порівнюючи отримані дані з нормою, роблять клініко- діагностичний висновок (стор. 43).

б) Хід визначення за калібрувальним графіком

1. Готують контрольний та досліджувані розчини, користуючись таблицею 1. Обережно перемішують, уникаючи появи піни. Витримують 30 хвилин (але не більше 1 години) при кімнатній температурі, потім фотометрують досліджувані розчини у кюветі з товщиною шару 10 мм за довжини хвилі 540–560 нм (зелений світлофільтр) проти контрольного розчину (розд. 2.1.2, 2.2).

2. Будують калібрувальний графік.

Із стандартного розчину білка і робочого розчину біу­ретового реактиву готують калібрувальні розчини, як вказано у таблиці 2.

Таблиця 2

Склад робочих калібрувальних розчинів

 

№ з/п	Стандартний розчин білка, мл	Робочий розчин біуретового реактиву, мл	Концентрація білка, г/л
	0,20	4,90
	0,15	4,95
	0,10	5,00
	0,05	5,05

 

Через 30 – 60 хвилин фотометрують калібрувальні розчини проти контрольного розчину аналогічно досліджуваним. За отриманими даними будують калібрувальний графік залежності екстинкції від концентрації білка.

3. Розрахунки.

За калібрувальним графіком, використовуючи значення екстинкції досліджуваних розчинів, знаходять відповід­не їм значення концентрації білка.

Порівнюючи отримані дані з нормою, роблять клініко- діагностичний висновок (стор. 43).