Цитохимическая характеристика клеток крови и костного мозга в норме

Цитохимическая характеристика элементов гемопоэза может быть проведена начиная со стадии морфологически распознаваемых пролиферирующих клеток (эритробласта, миелоб-ласта, монобласта, лимфобласта). При этом, при описании химических и энзимо-химичес-ких особенностей этого и других классов кроветворных клеток, предпочтение должно быть отдано реакциям, которые могут иметь диагностическое или дифференциально-диагности­ческое значение.

Уже в первой морфологически распознаваемой клетке гранулопоэза — миелобласте об­наруживаются все цитохимические признаки, свойственные этому ряду. В цитоплазме мие-лобластов выявляется положительная реакция при определении активности пероксидазы и хлорацетатэстеразы. При проведении PAS-реакции наблюдается диффузное окрашивание цитоплазмы, а при окраске Суданом черным В — умеренная суданофилия. В этих же клетках отмечается активность кислой фосфатазы, при выявлении которой интенсивность диффуз­ной окраски цитоплазмы колеблется от слабой до умеренной. Как и во всех пролиферирую­щих клетках гранулоцитарного ряда, в миелобластах не выявляется активность щелочной фосфатазы. Реакция при определении активности неспецифической эстеразы — слабо поло­жительная, не ингибируется фторидом натрия.

Как правило, активность разных ферментных систем, содержание гликогена и липидов увеличиваются по мере созревания клеточных элементов гранулоцитопоэза.

Нейтрофильные, эозинофильные и базофильные гранулоциты отличаются по ряду ци­тохимических признаков. В нейтрофильных палочко- и сегментоядерных лейкоцитах глико­ген выявляется в виде отдельных гранул вишневого цвета, выполняющих цитоплазму, или диффузной интенсивной окраски. В эозинофильных лейкоцитах гликоген располагается между специфическими гранулами, которые остаются неокрашенными. В базофильных гра-нулоцитах положительная PAS-реакция после предварительной обработки мазков амилазой сохраняется. Гранулы нейтрофильных лейкоцитов окрашиваются Суданом черным В в темно-серый или черный цвет. В зрелых эозинофильных гранулоцитах центральная часть су-данотрицательная, она окрашивается в желто-коричневый цвет, а периферия — суданополо-жительная. В эозинофильных миелоцитах, метамиелоцитах, палочко- и сегментоядерных лейкоцитах активность пероксидазы и кислой фосфатазы выше, чем в соответствующих ней­трофильных клетках, но зато совершенно не выявляется активность хлорацетатэстеразы и щелочной фосфатазы, которая в норме обнаруживается в 18—54 % зрелых нейтрофильных лейкоцитов периферической крови и костного мозга. В базофильных лейкоцитах также не выявляется активность этих ферментов и пероксидазы. Нейтрофильные, эозинофильные и

базофильные гранулоциты проявляют слабую или умеренную эстеразную активность при ис­пользовании в качестве субстрата а-нафтилацетата и нафтол-АБ-ацетата.

В клетках мегакариоцитарного ряда с помощью PAS-реакции выявляются многочислен­ные гранулы, окрашенные в вишнево-фиолетовый цвет. Столь же выраженную реакцию дают и тромбоциты. Контрольный тест с амилазой указывает на то, что определяемое веще­ство является гликогеном. При окраске Суданом черным В липиды в мегакариоцитах не об­наруживаются. Реакции на пероксидазу, хлорацетатэстеразу и щелочную фосфатазу дают от­рицательные результаты. Активность кислой фосфатазы, определяемая методом одновремен­ного азосочетания, в клетках мегакариоцитарного ряда и тромбоцитах умеренная; она пол­ностью подавляется при добавлении в инкубационную среду 0,05 М виннокислого калия-на­трия. Приблизительно такой же уровень активности в мегакариоцитах неспецифической эс-теразы, чувствительной к действию натрия фторида.

Наиболее характерным признаком моноцитов, как и всех клеток системы мононуклеар-ных фагоцитов, отличающим их от клеток остальных ростков кроветворения, является высо­кая активность неспецифической эстеразы, которая эффективно ингибируется при добавле­нии в инкубационную среду натрия фторида в концентрации 1,5 мг/мл (0,03М). В то же время этот ингибитор не оказывает влияния на более слабую активность этого фермента в других кроветворных клетках. В моноцитах крови умеренная и выраженная активность кис­лой фосфатазы, которая ингибируется ионами тартрата (виннокислого калия-натрия). По своей значимости в идентификации клеток системы мононуклеарных фагоцитов методика определения активности кислой фосфатазы приближается к маркерной реакции на неспеци­фическую эстеразу. В большей части моноцитов периферической крови выявляют актив­ность пероксидазы, уровень которой значительно ниже, чем в наиболее молодых клетках гранулоцитарного ряда. Для большей надежности можно использовать реакцию на выявле­ние нафтол-АБ-О-хлорацетатэстеразы. При этом в молодых и незрелых клетках нейтрофиль-ного ряда всегда фиксируют окрашивание цитоплазмы разной степени, а в моноцитах реак­ция всегда отрицательная [Глузман Д.Ф., 1978]. В моноцитах также незначительное количе­ство липидов и гликогена. По степени суданофилии моноциты значительно уступают клет­кам гранулоцитарного ряда. При PAS-реакции в цитоплазме моноцитов наблюдают диффуз­ное окрашивание или отложение мелких гранул по периферии клетки. Интенсивность ок­раски ниже, чем в зрелых гранулоцитах. Многие авторы указывают на выраженную цитохи­мическую гетерогенность этой группы клеток периферической крови [Глузман Д.Ф., 1978; Jansa, Papousek, 1971; Kaplow, 1975].

Лимфоциты — самые «бедные» в цитохимическом отношении клетки. Небольшая часть этих клеток содержит лишь выявляемые цитохимически гликоген (2—30 %), кислую фосфа­тазу и кислую а-нафтилацетатэстеразу. В них никогда не определяется активность перокси­дазы и нет липидов. Вместе с тем положительная реакция на кислую фосфатазу и кислую а-нафтилацетатэстеразу и тип реакции на эти ферменты позволяют разграничить различные виды лимфоцитов.

При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой ре­зультатов, используя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени ин­тенсивности специфической окраски. В зависимости от нее исследуемые клетки делят на 4 группы: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски суммируют и вычитают количест­во клеток без окраски, результат выражают в процентах. Например, при исследовании актив­ности миелопероксидазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток: в 2 — активность фермента не выявлена (—); в 3 — специфическая окраска была слабой (+); в 20 — более ин­тенсивной (++) и в 75 — резко положительной (+++). Результат определения активности миелопероксидазы в нейтрофилах в таком случае составит: (3 + 20 + 75) — 2 = 98 %.

Результат можно выразить в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК) по L. Kaplow (1955). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток оп­ределенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски, затем число кле­ток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумму этих произведений делят на 100, что и составляет СЦК. Например, при исследовании активности миелопероксидазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток: в 2 активность фермента не выявлена (-); в 3 специфическая окраска была слабой (+); в 20 более интенсивной (++) и в 75 резко положительной (+++). СЦК для одной клетки в таком случае составит:

(2 ■ 0) + (3 • 1) + (20 • 2) + (75 • 3): 100 = 2,68.

Нормы для всех цитохимических показателей клеток необходимо разрабатывать каждой ла­боратории отдельно. Это обусловлено наличием различных реактивов и степенью их чистоты.

Активность миелопероксидазы

Активность миелопероксидазы выявляют в клетках гранулоцитарного ряда, нейтрофи-лах и эозинофилах, начиная с некоторых миелобластов до сегментоядерных клеток, в виде гранул, заполняющих цитоплазму (табл. 2.1).

Таблица 2.1. Активность миелопероксидазы в норме [Меньшиков В.В., 1982]

 

Клетки	Активность, %	СЦК
Миелобласты		1,04-1,20
Миелоциты		1,72-1,84
Зрелые гранулоциты:
— костного мозга	90-95	2,0-2,8
— крови	96-100	2,14-2,92
Из них:
(+)	5-7
(++)	60-90
(+++)	3-16
Моноциты крови	83-88
Лимфоциты:
— костного мозга
— крови

В базофильных промиелоцитах и миелоцитах активность миелопероксидазы, как прави­ло, высокая, но выражена слабее в метамиелоцитах и почти отрицательная в зрелых базофи-лах. Сравнительно слабую по интенсивности положительную реакцию наблюдают в различ­ном проценте моноцитов в виде немногочисленных рассеянных гранул (табл. 2.2). Эритро­циты, лимфоциты и мегакариоциты реагируют отрицательно.

Таблица 2.2. Активность миелопероксидазы при различных формах лейкозов в бластах

[Marmont A.M. et al., 1981]

 

FAB-классификация лейкозов	Миелопероксидазная активность
МО (острый недифференцированный лейкоз) Ml (острый миелобластный лейкоз без созревания) М2 (острый миелобластный лейкоз с созреванием) МЗ (острый промиелоцитарный лейкоз) М4 (острый миеломонобластный лейкоз) М5 (острый монобластный лейкоз) Мб (острый эритромиелоз) М7 (острый мегакариобластный лейкоз) Острый лимфобластный лейкоз	Отрицательная Положительная То же»»»» Может быть положительная Положительная Отрицательная То же

Определение активности миелопероксидазы дает возможность дифференцировать мие­лобласты и моноцитарные предшественники от лимфобластов, всегда отрицательных в этой реакции, тогда как миелобласты и монобласты содержат гранулы миелопероксидазы. В мие-лобластах могут присутствовать пероксидазоположительные палочки Ауэра. В комплексе с другими цитохимическими методами активность миелопероксидазы определяют для того, чтобы объективно установить происхождение недифференцируемых при обычном исследо­вании клеток при различных вариантах острого лейкоза (табл. 2.3).

Таблица 2.3. Активность миелопероксидазы в нейтрофильных клетках при различных заболеваниях

 

Высокая активность	Снижение активности
Нелеченый хронический миелолейкоз	Инфекционные лейкоцитозы
Острый миеломонобластный лейкоз	Болезнь Ходжкина
Острый эритромиелоз	Некоторые метастазирующие опухоли
Острый промиелоцитарный лейкоз	Инфаркт миокарда
	Ревматизм, туберкулез
	Острый монобластный лейкоз
	Терминальная стадия хронического миелолейкоза