Обнаружение ГМ-сои с использованием мультиплексного анализа TaqMan qPCR

81

Реакционные компоненты

82

Велоспорт протокол

82

Анализ данных

82

Страница 80

обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО)

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

76

7. Генетически модифицированный

Обнаружение организма (ГМО)

ГМО, как правило, разрабатываются, чтобы придать полезные черты, начиная от улучшенных

Пищевая ценность к устойчивости к гербицидам и вредителям. Соя, кукуруза и хлопок

наиболее распространенные генетически модифицированные (ГМ) культуры. Спор по поводу ГМО-происхождения

еда заставила некоторые страны требовать раскрытия и маркировки содержания ГМО

на еду. В результате необходимы точные и надежные методы обнаружения ГМО.

Современные методы обнаружения ГМО включают методы на основе ПЦР и фермент-связанные

иммуносорбентные анализы (ELISA). Хотя ИФА относительно недороги и

быстрые, основанные на ПЦР методы предлагают дополнительные преимущества высокой чувствительности и

точность, надежность и возможность количественного определения ГМО, а также

качественно. КПЦР в реальном времени, например, может использоваться для определения

процентное содержание ГМО в образце пищи.

Устойчивая к гербицидам соя является примером ГМ пищевой культуры. Сопротивление к

Гербицид Глифосат присваивается путем введения трансгена, который восстанавливает

путь незаменимых аминокислот нарушен глифосатом. Трансген является

толерантная к глифосату версия енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы

(epsps) ген почвенной бактерии Agrobacterium sp. штамм cp4. Выражение

cp4 epsps в модифицированных растениях, таких как соя Roundup Ready, даёт

устойчивость к глифосату, что позволяет использовать глифосат на полях

эти ГМ-культуры.

Ген cp4 epsps экспрессируется из вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S

промоутер. Промотор CaMV 35S часто используется в ГМ-культурах, потому что он хорошо

определенные требования последовательности, выражается в широком диапазоне тканей, и делает

не нужны никакие вирусные транс-факторы. Из-за его распространенного использования в генетических

модификация культур, промотор CaMV 35S является полезной мишенью для КПЦР

предназначен для обнаружения ряда ГМО.

В этом разделе мы предоставляем протоколы для обнаружения устойчивой к глифосату сои из пищи

образцы с использованием ПЦР в реальном времени. Преимущества методов, описанных здесь

включают возможность тестирования нескольких образцов, необходимость в небольших количествах

исходный материал, применимость к сырой и обработанной пище, а также адаптируемость к

другие ГМ-культуры, такие как кукуруза, рис и арахис.

Страница 81

обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО)

Экспериментальная дизайн

7.1 Экспериментальный дизайн

Два метода ПЦР в реальном времени для обнаружения и количественного определения ГМ сои в пищевых продуктах:

представлен здесь (См. Раздел 2.2.2 для обсуждения химии в реальном времени

(SYBR Green I и TaqMan), а также раздел 2.2.1 для одиночного и мультиплексного

соображения.) Первый протокол представляет собой одноцветный (однократный) анализ, в котором используется SYBR.

Зеленый I для определения ГМО-специфической последовательности (трансгенный гербицид

резистентность) и эндогенной эталонной последовательности (соевый лектин) в отдельности,

параллельные реакции. Второй протокол представляет собой двухцветный мультиплексный анализ, который использует

TaqMan-зонд с дифференциальной маркировкой: один для обнаружения ГМО-специфического промотора

(промотор CaMV 35S) и другой, чтобы обнаружить эндогенный

эталонная последовательность (соевый лектин), где обе реакции проводят в одном

реакционный сосуд. Эндогенный эталонный ген сои был использован для нормализации

количество ГМ сои к общему количеству сои в пробе. Количество ГМ

сою количественно определяли путем интерполяции с использованием стандартной кривой, полученной из

набор сертифицированных эталонных стандартов, как подробно обсуждается в анализе данных

раздел ниже.

7.2 Экстракция ДНК и образец

Подготовка к обнаружению ГМО

В качестве эталонных стандартов использовали сухой соевый порошок, содержащий массовые доли

0–5% сои Roundup Ready (Sigma). Эти эталонные стандарты были

приготовленный производителем путем смешивания сухого соевого порошка без ГМ с

Раундап Готовый соевый порошок. Испытанные образцы пищи (соевый бургер, соя

десерт и две марки соевой муки) были получены из супермаркета.

Сухие образцы, эталонные стандарты и соевая мука были использованы непосредственно в

процедура выделения ДНК, в то время как влажные образцы, соевый бургер и соя

Десерт, были пюре до тонкой, однородной пасты с ступкой и пестиком.

Для ПЦР-анализа в реальном времени, описанного в разделах 7.3 и 7.4, ДНК

шаблоны были изготовлены из эталонных стандартов и образцов пищевых продуктов с использованием

DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) с использованием методов, описанных в протоколе набора.

Концентрации ДНК определяли с помощью спектрофотометрии и качества

проверено электрофорезом на 1% агарозном геле. Как правило, мы получили 1–2 мкг

ДНК из 55–100 мг каждого образца пищи.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

77

Страница 82

обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО)

Обнаружение ГМ-сои с использованием одноплексного анализа SYBR Green I qPCR

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

78

7.3 Обнаружение сои ГМ с использованием

Singleplex SYBR Green I QPCR-анализ

После того, как ДНК была выделена из пищевых и контрольных образцов, как описано в разделе

7.2, доля устойчивой к глифосату сои в образцах пищевых продуктов на основе сои составляла

определяли с использованием одноплексного анализа SYBR Green I КПЦР, описанного в этом

раздел. Этот анализ обнаруживает специфическую для ГМО последовательность, которая

Ген Agrobacterium cp4 epsps и контроль эндогенной геномной ДНК

последовательность из гена соевого лектина, которая экспрессируется как в GM, так и в немодифицированном виде

соя. Поскольку флуоресценция SYBR Green I не является специфичной для мишени и не может

различать ГМО-специфическую мишень и эндогенную соевую мишень,

амплификацию этих мишеней проводили в отдельных лунках параллельно, в одиночном положении

реакции. (См. Раздел 2.2.2 для обсуждения химии в реальном времени (SYBR Green I),

и раздел 2.2.1 для одноплексных и мультиплексных соображений.) процент ГМО,

которая является частью общего содержания сои в образцах пищевых продуктов на основе сои, составляет

определяется путем сравнения с эталонными стандартами и может быть количественно оценен до

приблизительно 0,5% (мас. / мас.) концентрация в этом анализе с использованием этих стандартов.

Компоненты реакции

Для амплификации ГМО-специфической последовательности (область 356 п.н. гена cp4 epsps),

использовались следующие праймеры: вперед, 5'-TGG CGC CCA AAG CTT GCA TGG C-3 'и

обратный, 5'-CCC CAA GTT CCT AAA TCT TCA AGT-3 '. Усилить эндогенный

контроль, область в 318 п.н. гена соевого лектина, который экспрессируется как в ГМ, так и в

не-GM соя, праймеры были: вперед, 5'-GAC GCT ATT GTG ACC TCC TC-3 '

и наоборот: 5'-GAA AGT GTC AAG CTT AAC AGC GAC G-3 '.

Хотя описанные здесь компоненты в анализе SYBR Green I были добавлены

индивидуально, предварительно приготовленные мастер-смеси для ПЦР, содержащие буфер, ДНК-полимеразу,

dNTP и краситель SYBR Green I, такой как супермикс iQ ™ SYBR ® Green, также могут быть

используемый. Реакционные компоненты для описанных одноплексных анализов SYBR Green I

здесь и их окончательные концентрации перечислены ниже. Отдельные реакции были

собранный для амплификации специфичного для ГМО гена cp4 epsps и соевого лектина

эндогенный контрольный ген, используя соответствующие праймеры, перечисленные выше.

100 нг / мкл ДНК

250 нМ каждого праймера

200 мкМ dNTPs

2 мМ MgCl 2

1x Mg 2+ -без буфера

0,5x SYBR Зеленый I

0,02 Ед / мкл ДНК-полимеразы DyNAzyme II (Finnzymes)

Стерильная, не содержащая нуклеазы вода до конечного объема 20,0 мкл

Страница 83

обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО)

Обнаружение ГМ-сои с использованием одноплексного анализа SYBR Green I qPCR

Протокол езды на велосипеде

Параллельная амплификация специфичных для ГМО cp4 epsps и последовательностей соевого лектина

были выполнены на системе DNA Engine Opticon ® 2 с использованием протокола, приведенного ниже:

1. 94 ° С, 3 мин

2. 94 ° С, 10 сек

3. 60 ° С, 15 сек

4. 72 ° С, 20 сек

5. 86 ° С, 2 сек

6. Тарелка прочитана

7. Перейдите к шагу 2, еще 39 раз

8. 72 ° С, 10 мин

9. Анализ кривой плавления: от 65 до 98 ° С, 0,2 ° С / считывание, выдержка 1 с

10. 72 ° С, 10 мин

Конец

Анализ данных

Поскольку описанный здесь анализ использует SYBR Green I, мы убедились, что каждая цель

был специфически усилен (т. е. неспецифические ампликоны не продуцировались)

Анализ кривой, который показал один пик для каждого ампликона (данные не показаны).

См. Раздел 2.2.2.1 для получения подробной информации о том, как анализ кривой плавления может быть использован для анализа

специфичность анализа КПЦР на основе SYBR Green I.

Процент содержания ГМ сои в образцах пищевых продуктов рассчитывали в три этапа:

1) ГМ сои нормализовали до общего содержания сои, получая AC T, 2) стандартную кривую

был создан с использованием эталонных стандартов (AC T по сравнению с log% GMO), и 3)

Процент ГМ сои в образцах пищевых продуктов рассчитывали путем интерполяции AC T

Значения нормализованных образцов с использованием стандартной кривой. Детали для каждого шага

приведены ниже:

1. ГМ сои нормализовали по общему количеству сои путем расчета значения T AAC. C T T

от управления усилением (соевый лектин) вычитают из C T из

ГМО-специфическая амплификация (epsps). Для стандартов и образцов, которые не

амплифицировали продукт праймерами epsps, значение AC T было обозначено как

не обнаружено (НД).

AC T = C T (ГМО epsps) - C T (лектин)

Использование AC T предполагает, что обе реакции имеют одинаковую эффективность и

что они действуют взаимно независимым образом, так как они были выполнены в

отдельные колодцы.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

79

Страница 84

обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО)

Обнаружение ГМ-сои с использованием одноплексного анализа SYBR Green I qPCR

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

80

2. Стандартная кривая была создана с использованием эталонных стандартов: AC T

Значения эталонных стандартов были нанесены на ось X и log% ГМО

стандартов были нанесены на ось Y. Рисунок 7.1 показывает ссылку

стандарты на 0–5% ГМО. Данные из эталонных стандартов были адаптированы к

линии с помощью функции диаграммы Microsoft Excel «Добавить линию тренда». Функция также

возвращает значение R 2, которое указывает, насколько хорошо линейное уравнение соответствует данным.

Таблица 7.1. Расчет A C T = C T (epsps) - C T (лектин)

Стандартный образец

C T (epsps)

C T (лектин)

A C T

0,0% ГМО стандарт

Северная Дакота

19,68

Северная Дакота

0,1% ГМО стандарт

Северная Дакота

19,78

Северная Дакота

0,5% стандарт ГМО

26,85

19,58

7,27

1,0% стандарт ГМО

25,62

19,52

6,10

2.0% стандарт ГМО

24,56

19,70

4,86

5,0% ГМО стандарт

22,94

19,48

3,46

Соевый десерт

22,78

19,27

3,51

Соевая мука

Северная Дакота

18,13

Северная Дакота

Соевый бургер

22,32

19,91

2,41

Рис. 7.1. Стандартная кривая, полученная из значений AC T эталонных стандартов сои.

Показано% ГМО в каждом стандарте. Значение R 2 было 0,999.

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

вот

грамм

%

грамм

M

О

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00

-0,20

-0,40

AC T

у = –0,261х + 1,559

R 2 = 0,999

Страница 85

обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО)

Обнаружение ГМ сои с использованием мультиплексного анализа TaqMan I qPCR

3. Процент ГМ-сои в пробных образцах пищи рассчитывали интерполяцией

используя стандартную кривую с методом наименьших квадратов, используя функцию тренда

в программном обеспечении Excel. В функции Trend следующие значения были указаны для

стандарты: log% GMO (известные значения y), AC T (известные значения x) и

AC T образца пищи для нового х. Эта функция вернула значение журнала

% ГМО от образца пищи. Процент содержания ГМО сои в образце составил

затем определяется по формуле 10 (log% ГМО).

7.4 Обнаружение сои ГМ с использованием

Мультиплексный анализ TaqMan кПЦР

После того, как ДНК была выделена из пищевых и контрольных образцов, как описано в

Раздел 7.2, фракция устойчивой к глифосату сои (т.е. ГМ сои) в соевой основе

образцы пищи определяли с использованием другого анализа qPCR, мультиплексного TaqMan

Анализ описан в этом разделе. Этот анализ обнаруживает ГМО-специфическую последовательность

(последовательность из 35S-промотора CaMV) и эндогенная контрольная последовательность

от гена соевого лектина, который присутствует как в ГМ, так и в немодифицированной сое.

Специфичность последовательности зондов TaqMan позволяет усиливать и детектировать

из более чем одной реакции в одном реакционном сосуде. В этом однотрубном анализе,

FAM-меченный зонд использовали для обнаружения промоторной последовательности CaMV 35S,

в то время как VIC-меченный зонд был использован для обнаружения соевого лектина. (См. Раздел 2.2.2 для

обсуждение химии в режиме реального времени (TaqMan) и раздел 2.2.1 для однократного и

мультиплексные соображения.) Процент ГМ сои, который является частью общего

содержание сои в образцах пищевых продуктов на основе сои, определяется путем сравнения с

эталонные стандарты и могут быть количественно оценены до примерно 0,5% (вес / вес)

концентрация в этом анализе.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

81

Таблица 7.2. Определение процента ГМ сои.

Образец

A C T

% GMO

Соевый десерт

2,1

4,40

Соевая мука *

Северная Дакота

0-0,5

Соевый бургер *

0.7

> 5

* Они были вне диапазона концентраций стандартов.

Страница 86

обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО)

Обнаружение ГМ сои с использованием мультиплексного анализа TaqMan qPCR

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

82

Компоненты реакции

Компоненты для мультиплексного анализа TaqMan для обнаружения ГМ сои описаны

здесь перечислены ниже. Праймеры, зонды, дНТФ, MgCl 2 и буфер были из

предварительно составленный набор (набор для обнаружения TaqMan GMO Soy 35S, Applied Biosystems).

ГМО-специфичный промотор CaMV 35S был амплифицирован с использованием ГМО-специфических праймеров

и обнаружен FAM-меченным зондом, тогда как эндогенный контрольный ген сои был

амплифицировали с помощью пектиновых праймеров и определяли с помощью VIC-меченного зонда в том же

реакционная труба:

2,0 мкл ДНК

17,5 мкл ГМО-набора (Applied Biosystems)

0,5 мкл AmpliTaq Gold (Applied Biosystems)

20,0 мкл конечного объема

Протокол езды на велосипеде

Усиление ГМО-специфического промотора CaMV 35S и соевого лектина

Последовательности были выполнены на системе ДНК Engine Opticon 2 с использованием

протокол ниже:

1. 94 ° С, 9 мин

2. 96 ° С, 20 сек

3. 60 ° С, 1 мин

4. 72 ° С, 30 сек

5. Тарелка прочитана

6. Перейдите к шагу 2, еще 39 раз

Конец

Анализ данных

Как описано в разделе 7.3.3, процентное содержание ГМ сои в образцах пищевых продуктов было

рассчитывается в три этапа: 1) ГМ сои нормализовали до общего содержания сои, 2)

стандартная кривая была получена с использованием эталонных стандартов (AC T по сравнению с log% GMO),

и 3) процент сои в образцах пищи, которые были генетически модифицированы, был

рассчитывается путем интерполяции значений AC T нормированных выборок с использованием

стандартная кривая. Анализ и результаты мультиплексного анализа TaqMan

следующее:

1. ГМ соя была нормирована на общие сои путем вычисления переменного тока Т значения. Для стандартов

и образцы, которые не амплифицировали продукт с праймерами CaMV, AC T

значение было обозначено как «не обнаружено» (ND).

AC T = AC T (CaMV) - AC T (лектин)

Страница 87

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

83

обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО)

Обнаружение ГМ сои с использованием мультиплексного анализа TaqMan qPCR

2. Создайте стандартную кривую, используя эталонные стандарты. Рисунок 7.2 показывает

эталонные стандарты для 0–5% ГМО.

Таблица 7.3. Расчет A C T = C T (epsps) - C T (лектин)

Стандарт или образец

C T (CaMV)

C T (лектин)

A C T

0,0% ГМО стандарт

Северная Дакота

24,40

Северная Дакота

0,1% ГМО стандарт

35,96

24,30

11,66

0,5% стандарт ГМО

33,19

23,60

9,59

1,0% стандарт ГМО

32,12

23,60

8,52

2.0% стандарт ГМО

31,34

24,00

7,34

5,0% ГМО стандарт

29,76

23,80

5,96

Соевый бургер

27,22

21,85

5,37

Соевая мука

Северная Дакота

20,73

Северная Дакота

Рис. 7.2. Стандартная кривая, полученная из значений AC T эталонных стандартов сои.

Показано% ГМО в каждом стандарте. Значение R 2 было 0,996.

0,00

5,00

10,00

15.00

вот

грамм

%

грамм

M

О

1,0

0,5

0

-0,5

-1,0

-1,5

AC T

у = –0,295х + 1,559

R 2 = 0,996

3. Определить содержание ГМО в образцах пищевых продуктов путем интерполяции с использованием

стандартная кривая.

Таблица 7.4. Определение процента ГМ сои.

Образец

A C T

% GMO

Соевый бургер *

4,41

> 5

Соевая мука *

Северная Дакота

0-0,1

* Они были вне диапазона концентраций стандартов.

Страница 88

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

84

Страница 89

Продукт

Руководство

Системы обнаружения ПЦР в реальном времени

86

Реагенты для пробоподготовки

86

Пример оценки

86

Наборы обратной транскрипции

87

Реагенты в реальном времени

88

Обычные реагенты для ПЦР

88

пластики

89

Програмное обеспечение

89

Страница 90

руководство по продукту

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

86