Анализ данных аллельной дискриминации

59

Валидация анализа аллельной дискриминации

59

Генотип Назначения

72

Страница 58

генотипирование / аллельная дискриминация

Экспериментальная дизайн

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

54

6. Генотипирование / Аллелик

дискриминация

Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) обычно являются вариациями последовательности ДНК

встречается среди людей в результате однократных замен пар оснований. В общем,

изменение аллельной последовательности считается полиморфизмом ДНК, если более одного

аллель обнаружен в одном локусе с частотой более 1% у человека

Население. Вариации последовательности ДНК играют важную роль во многих процессах,

такие как восприимчивость человека к болезням и его или ее реакция на наркотики

терапии. SNP также полезны при изучении вклада отдельных генов

к болезням, имеющим сложную мультигенную основу.

Идентификация SNP, и, следовательно, изучение человеческого разнообразия и заболеваний,

была облегчена разработкой молекулярных инструментов для определения ДНК

меняется. Обнаружение SNP, генотипирование или аллельная дискриминация могут быть выполнены

такими способами, как аллель-специфическая ПЦР, удлинение аллель-специфического праймера,

анализ лигирования олигонуклеотидов и одноцепочечный конформационный полиморфизм

(SSCP) анализ. Совсем недавно, методы генотипирования SNP на основе ПЦР в реальном времени

приобрели популярность в исследовательских и диагностических лабораториях. ПЦР в реальном времени

технологии имеют много преимуществ по сравнению с традиционными методами генотипирования,

включая более высокую пропускную способность, сниженный риск перекрестного загрязнения и

уменьшенный труд.

В этой главе мы даем общие рекомендации по аллельной дискриминации с использованием реальных

время ПЦР с TaqMan зондами. Пример протокола для генотипирования двух факторов риска

венозного тромбоза у кавказцев. Анализ может быть легко адаптирован к

обнаружить другие SNP.

Страница 59

генотипирование / аллельная дискриминация

Экспериментальная дизайн

6.1 Экспериментальный дизайн

Анализ генотипирования и обнаружения SNP с использованием ПЦР в реальном времени может быть разработан в

разными способами и с разными химическими составами на основе зондов (см. раздел 2.2.2.2),

в том числе TaqMan зонды и молекулярные маяки. Ниже мы обсудим, как

TaqMan-зонды могут различать аллельные варианты, и мы представляем специальные

соображения относительно аллельной дискриминации с помощью TaqMan-зондов, включая праймер и

конструкция зонда, мультиплексирование и проверка.

Как зонды TaqMan используются для различения аллельных вариантов?

TaqMan-зонды, используемые для аллельной дискриминации, дифференциально маркированы флуоресцентными

зонды, специфичные для каждого аллеля. Один зонд специфичен для дикого типа (WT)

аллель и другой зонд специфичны для аллельного варианта. Зонды дифференциально

помечены 5 'флуоресцентным репортерным красителем и подходящим 3' гасителем

(см. Раздел 2.4.1 для выбора репортера и гасителя). Как показано на рисунке 6.1,

преимущественная гибридизация идеально подобранного зонда по сравнению с несовпадающим

Зонд позволяет различать аллельные варианты. Подходящий TaqMan

зонд специфически гибридизуется с ампликоном во время совместного отжига /

стадия удлинения и 5'-экзонуклеазная активность расщепления ДНК-полимеразы

от флуорофора, отделяя его от гасителя, чтобы выпустить флуоресцентный сигнал

для согласованного аллельного варианта. Несвязанный зонд несоответствующего аллеля

вариант не расщепляется и остается закаленным. Количество аллельных вариантов

обнаруженный будет зависеть от вашего экспериментального дизайна и количества флуоресцентных

красители поддерживаются вашим инструментом в реальном времени. ICycler iQ ®, Chromo4 ™ и iQ ™ 5

системы способны одновременно контролировать до четырех различных красителей и, таким образом,

может различать до четырех аллельных вариантов с использованием флуоресцентных аллель-специфических зондов.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

55

Репортер 1

расширение

Гаситель 1

Совпадение

С

Грамм

С

Грамм

R1

R2

Q2

Q1

R1

R1

Q1

Q1

расширение

Нет флуоресценции

Несоответствие

T

Грамм

Грамм

Репортер 2

Гаситель 2

R2

Q2

T

R2

Q2

Рис. 6.1. Механизм аллельной дискриминации с использованием анализа TaqMan.

Страница 60

генотипирование / аллельная дискриминация

дизайн праймера и зонда с использованием зондов TaqMan

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

56

Как упоминалось выше, анализы для генотипирования или обнаружения SNP с помощью ПЦР в реальном времени

могут быть разработаны различными способами и будут зависеть от ваших экспериментальных

система. Для простой дискриминации от двух до четырех SNP на один нуклеотид

положение с использованием зондов TaqMan, вам нужно разработать пару праймеров для усиления

один ампликон и два-четыре аллель-специфических зонда, каждый с разным

флуоресцентная метка. Для обнаружения SNP в нескольких положениях нуклеотидов, один или несколько

ампликоны могут быть использованы. Например, мультиплексный анализ может быть разработан для

объединить две области, и две пары аллель-специфических зондов будут различать SNP

в каждом ампликоне.

Ниже мы опишем многоцветный мультиплексный анализ ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan

исследования для одновременной дискриминации аллельных вариантов двух наиболее

общие генетические факторы риска развития венозного тромбоза у кавказцев, фактор V

Лейден (FVL) и протромбин (PT) G20210A мутации. Этот однотрубный мультиплекс

В анализе используются: 1) две пары праймеров для одновременной амплификации последовательностей из

ген фактора свертывания крови V (который имеет мутацию FVL G1691A) и из

ген фактора свертывания крови II (который имеет мутацию PT G20210A) и 2) две пары

аллель-специфических зондов; каждая пара зондов различает WT и

мутантный аллель для каждой мишени.

6.2 Учебник для начинающих и исследования

Использование TaqMan Probes

Руководства, представленные в этом разделе для разработки праймера и TaqMan для

аллельная дискриминация несколько отличается от общих указаний в разделе 2.4.1.

Для разработки праймеров для анализов аллельной дискриминации, описанных здесь, мы использовали

Программное обеспечение Oligo 6 (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO) и

общие указания в Разделе 2.4.1 данного руководства (избегайте праймеров-димеров, шпилек,

и самодополняющие последовательности), за исключением того, что праймеры были разработаны с

Т м ~ 55 ° С. Праймеры также были разработаны для совместимости в мультиплексной ПЦР

реакция (то есть, они были разработаны, чтобы иметь аналогичные значения T m и избежать

комплементарность между всеми праймерами и зондами; см. раздел 3.1). Мы разработали

два набора праймеров для коамплификации последовательности в 97 п.н. из гена фактора свертывания крови V

и последовательность в 111 б.п. от PT; каждый ампликон охватывал область, чтобы быть

генотипирован (мутации FVL и PT G20210A). Праймеры, используемые для амплификации

Ген фактора свертывания крови V: прямой, 5'-TCT GAA AGG TTA CTT CAA GGA C-

3 'и наоборот, 5'-ATC GCC TCT GGG CTA ATA-3'. Праймеры использовали для амплификации

PT были: вперед, 5'-TTG TGT TTC TAA AAC TAT GGT TCC-3 'и задний ход,

5'-AGT AGT ATT ACT GGC TCT TCC T-3 '.

Страница 61

генотипирование / аллельная дискриминация

Выделение ДНК и пробоподготовка

Для аллельной дискриминации аллель-специфичные зонды TaqMan должны быть сконструированы таким образом, чтобы

что зонд для соответствующего аллельного варианта связывает мишень с высокой специфичностью,

в то время как зонд для несоответствующего аллельного варианта не должен связываться. Мы нашли

что WT и мутантные аллели могут быть эффективно различены путем разработки зондов

короткие (T m ~ 55 ° C) и помещая полиморфный нуклеотид в середину

зонда. Обратите внимание, что эти правила проектирования зондов отличаются от тех, которые предлагаются

Livak (1999) и те, которые обсуждались в разделе 2.4.1 (зонды с T m ~ 65–67 ° C,

длина ~ 23–26 оснований; грунтовки с Т м 58–60 ° С). Хотя зонды с высоким

Значения T m хорошо работают для количественных экспериментов, мы рекомендуем более короткий TaqMan

зонды аллельной дискриминации.

Для выявления аллельных вариантов FVL и PT G20210A мы разработали зонды

дополняют последовательности, охватывающие мутации в мишенях. зонды

были разработаны, чтобы быть относительно короткими (17–19 оснований, T m = 55 ± 1,5 ° C), и

Полиморфный нуклеотид был помещен в центр зондов. Зонды, которые

различают фактор свертывания крови V дикого типа и мутантный аллель FVL

были 5 '- [FAM] -TGG ACA GGC GAG GAA TAC- [Гаситель черной дыры 1] -3' (для

фактор свертывания крови V дикого типа) и 5 ​​'- [TET] -TGG ACA GGC AAG GAA TAC A-

[Black Hole Quencher 1] -3 '(для мутанта FVL G20210A). Зонды, которые различают

между PT дикого типа и мутантным аллелем G20210A метили 5 '- [TAMRA] -

CTC TCA GCG AGC CTC AA- [Гаситель черной дыры 2] -3 '(для PT дикого типа), и

5 '- [Texas Red] -ACT CTC AGC AAG CCT CAA- [Гаситель черной дыры 2] - 3' (для PT

Мутант G20210A).

6.3 Экстракция ДНК и

Базовые приготовления

Для анализа и генотипирования SNP геномную ДНК человека обычно готовят из

цельная кровь, клеточные линии или ткани (для выявления мутаций опухоли). Мы готовы

наши шаблоны геномной ДНК с использованием набора крови для геномной ДНК AquaPure ™ или

матрица InstaGene ™ (см. руководство по продукту). Для облегчения денатурации нетронутыми,

высокомолекулярная геномная ДНК, вам может понадобиться подготовить вашу геномную ДНК

шаблон с использованием следующих шагов: 1) переваривать рестриктазой, которая не

разрезать в области для амплификации и / или 2) кипятить запас ДНК в течение 10 мин и поместить

сразу на льду.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

57

Страница 62

генотипирование / аллельная дискриминация

компоненты реакции с использованием зондов TaqMan

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

58

Для анализа, описанного здесь, образцы цельной крови от 52 человек с

Генотипы FVL и PT G20210A, ранее определенные с помощью PCR-RFLP, были

используется для приготовления геномной ДНК человека с использованием стандартных процедур.

Концентрации и чистота ДНК обычно измеряются с помощью спектрофотометрии

(отношение УФ-поглощения при 260 нм и 280 нм) или связывание нуклеиновой кислоты с красителем

анализ (например, краситель Hoechst или PicoGreen для двухцепочечной ДНК) и

флуорометр, такой как флуорометр VersaFluor ™ (см. Руководство по продукту).

Приблизительно 10 нг ДНК использовали для каждой многоцветной мультиплексной реакции.

описано здесь.

6.4 Компоненты реакции при использовании

TaqMan Probes

Хотя мы добавили отдельные компоненты для аллельной дискриминации TaqMan

анализ описан здесь отдельно, предварительно составленные ПЦР-мастер-смеси, содержащие

также можно использовать буфер, ДНК-полимеразу и dNTP, такие как супермикс iQ ™.

Каждая реакция содержит: 1) два набора праймеров (всего четыре праймера) для коамплификации

последовательности гена фактора свертывания крови V и гена PT, и 2) две пары

дифференциально меченные аллель-специфические зонды (всего четыре зонда) для специфического обнаружения

WT и мутантные аллели для каждого гена. Реакционные компоненты для мультиплекса

Анализ дискриминации аллелей TaqMan, описанный здесь, и их окончательные концентрации

перечислены ниже:

10 нг ДНК-шаблон

400 нМ каждый праймер

400 нМ каждый зонд

200 мкМ каждый dNTP

3 мМ MgCl 2

20 мМ Трис-HCl, рН 8,4

50 мМ KCl

2.25 U iTaq ™ ДНК-полимераза

Стерильная вода без нуклеаз до конечного объема 25,0 мкл

Мы рекомендуем вам приготовить реакционную смесь, содержащую достаточно

реагенты для генотипирования неизвестных образцов ДНК и контролей, а также избыток к

покрыть потенциальные ошибки пипетирования. Для самых надежных результатов мы также рекомендуем

генотипирование по крайней мере трех повторностей каждого из ваших контролей (аллели WT, мутант

аллели и контроль без шаблонов).

Страница 63

генотипирование / аллельная дискриминация

велосипедный протокол с использованием зондов TaqMan

6.5 Оптимизация

Определить температуру отжига, которая дала бы наибольшую удельную

сигналы для каждого аллель-специфического зонда, мы воспользовались функцией градиента

система обнаружения ПЦР в реальном времени iCycler iQ ®. Дикий тип и контроль мутантов

ДНК для каждого фактора генной коагуляции (V и PT), а также отсутствие матрицы

контрольные, были испытаны в эксперименте по оптимизации температурного градиента. Мы

исследовали восемь температур в диапазоне от 55 до 70 ° С в одном эксперименте.

Для этой мультиплексной реакции ПЦР мы обнаружили, что комбинированный отжиг праймер / зонд

и удлинение при 58 ° С в течение 45 с дало наилучшее различие между аллелем

проверенные варианты (данные не показаны).

6.6 Протокол использования велосипеда

TaqMan Probes

Коамплификация последовательностей, которые охватывают мутации FVL и PT G20210A

был выполнен в системе iCycler iQ в соответствии с протоколом ниже.

Данные флуоресценции, полученные при расщеплении соответствующих аллель-специфических зондов

собирали на стадии отжига / удлинения при 58 ° C.

Цикл 1

1 повторение

95 ° С в течение 3,5 мин

Цикл 2

50 повторений

Шаг 1

95 ° C в течение 10 секунд

Шаг 2

58 ° C в течение 45 секунд (сбор данных)

6.7 Анализ данных аллельной дискриминации