Метод с использованием эталонного гена

Метод ΔC T с использованием эталонного гена является разновидностью метода Ливака, который

Проще выполнить и дает по существу те же результаты. В отличие от

ΔC T значения, полученные в разделе 4.2.2, этот метод использует разницу между

контрольные и целевые значения C T для каждого образца. Несмотря на простоту

подход, это действительно нормализованное выражение. Уровень выражения ссылки

ген учитывается. Ключевое отличие в результатах заключается в том, что выражение

Значение калибратора образца не 1,0. Если в результате значения выражения

полученные по этому методу делятся на значение выражения выбранного калибратора,

результаты этого расчета точно такие же, как и полученные с

2 –∆∆C T метод:

Соотношение (ссылка / цель) = 2 C T (ссылка) - C T (цель)

Страница 47

анализ данных КПЦР в реальном времени

относительная количественная оценка

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

43

Математические предположения для этого подхода такие же, как и для

2 –∆∆C T метод.

Пример: кДНК, представляющая 50 нг общей РНК, выделенной как из нормальной, так и из

Клетки опухоли яичника анализировали в трех экземплярах на предмет сообщения р53 и GAPDH.

Предыдущие исследования пришли к выводу, что GAPDH является хорошим эталонным геном для этого

исследование. Результаты показаны ниже:

Образец

C T p53 (цель)

C T GAPDH (ссылка)

Нормальный (калибратор)

15,0

16,5

Опухоль (тест)

12,0

15,9

Чтобы вычислить относительное выражение, просто нормализуйте выражение p53 для каждого образца:

2 (C T (GAPDH) - C T (p53)) = выражение

Для нормальных клеток это дает 2 (16,5 - 15) = 2,8

Для опухолевых клеток это дает 2 (15,9 - 12) = 14,9

Хотя, на первый взгляд, эти результаты выглядят совершенно иначе, чем полученные

используя метод 2 –∆∆C T, можно быстро оценить соотношение между двумя образцами

покажет, что они дают точно такие же результаты:

Нормальное выражение = Normal / Normal = 2.8 / 2.8 = 1

Выражение опухоли = опухоль / нормальный = 14,9 / 2,8 = 5,3

Метод Пфаффля

Метод 2 –∆∆C T для расчета относительной экспрессии генов действителен только тогда, когда

Эффективность амплификации целевого и эталонного генов одинакова. Если

Эффективность усиления двух ампликонов не одинакова, альтернатива

Формула должна быть использована для определения относительной экспрессии целевого гена в

разные образцы. Определить соотношение экспрессии между образцом и

калибратор, используйте следующую формулу:

Соотношение =

(E target) ∆C T, цель (калибратор - тест)

(E ref) ΔC T, ref (калибратор - испытание)

Страница 48

количественный анализ данных ПЦР

относительная количественная оценка

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

44

В вышеприведенном уравнении E target и E ref являются эффективностями усиления цели

и эталонные гены соответственно. ∆C T, цель (калибратор - тест) = C T цели

ген в калибраторе за вычетом C T целевого гена в тестируемом образце, и

∆C T, ref (калибратор - тест) - это C T эталонного гена в калибраторе минус

C T эталонного гена в тестовом образце.

Приведенное выше уравнение предполагает, что каждый ген (цель и эталон) имеет одинаковый

Эффективность усиления в тестовых образцах и калибраторах, но это не обязательно

что целевые и эталонные гены имеют такую ​​же эффективность амплификации, что и

друг с другом.

Метод 2 –∆∆C T и метод Пфаффля очень тесно связаны; на самом деле, 2 –∆∆C T

Метод является просто частным случаем метода Пфаффля, где E target = E ref = 2. Если мы

замените E target и E ref на 2, тогда метод Pfaffl упрощается следующим образом:

Соотношение =

= 2 - [(C T, цель (тест) - C T, цель (калибратор)] - [(C T, ссылка (тест) - C T, ссылка (калибратор)]

= 2 –∆∆C T

2 ∆C T, цель (калибратор - тест)

2 ∆C T, ref (калибратор - тест)

Страница 49

Экспрессия генов

Анализ

Экспериментальная дизайн

46

Изоляция РНК

47

Сбор образцов

47

РНК Экстракция

48

Анализ количества и качества нуклеиновых кислот

48

Подготовка матрицы кДНК (обратная транскрипция)

49

Разработка анализа КПЦР

50

Экспериментирование

51

Реакционные компоненты для мультиплексного анализа

51

Велоспорт протокол

51