Относительная количественная оценка

37

Когда следует использовать относительную количественную оценку?

37

Относительная количественная оценка, нормированная на единицу массы

38

Относительная количественная оценка, нормированная на эталонный ген

40

Метод 2 –AAC T (Ливак)

41

Метод AC T с использованием эталонного гена

42

Метод Пфаффля

43

Страница 38

анализ данных КПЦР в реальном времени

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

34

4. КПЦР в реальном времени

Анализ данных

Как обсуждалось в разделе 1, КПЦР в реальном времени является методом определения суммы

нуклеиновой кислоты в образце. Зная, что у вас есть 500 000 молекул р53

мРНК в пробирке, однако, не имеет биологического смысла; биологи

как правило, больше заинтересованы в таких утверждениях, как: 1) количество вирусных частиц в

заданное количество крови, или 2) кратное изменение мРНК р53 в «эквиваленте

количество раковых и нормальных тканей. Методы анализа, которые обращаются к этим

два сценария обычно известны как абсолютное количественное и относительное

количественная оценка, соответственно.

Абсолютное количественное определение достигается путем сравнения значений C T теста

образцы к стандартной кривой. Результатом анализа является количество нуклеиновой кислоты

(количество копий, мкг) на данное количество образца (на клетку, на мкг общей РНК). В

относительная количественная оценка, результат анализа представляет собой отношение: относительная сумма (крат

различие) целевой нуклеиновой кислоты для эквивалентных количеств теста и контроля

образец А против В. В обоих случаях необходимо рассмотреть вопрос о том, что такое «количество

выборка»и в относительном выражении, чтобы гарантировать, что эквивалентные количества

образцы сравниваются.

Как для абсолютных, так и для относительных методов количественного определения, величины, полученные из

эксперимент с КПЦР должен быть нормализован таким образом, чтобы данные

биологически значимый. Это делается с помощью нормализаторов. В абсолюте

количественная оценка, нормализаторы используются для корректировки или стандартизации полученной цели

количество на единицу количества образца. В относительном выражении нормализаторы

используется для обеспечения того, чтобы целевые количества из эквивалентных количеств образцов

по сравнению. Хотя нормализатор для любого метода количественного определения может быть

количество клеток, использованных для приготовления матрицы, мкг нуклеиновой кислоты, используемой в качестве ПЦР

шаблон или уровень экспрессии эталонного гена, первые два более

обычно используется для абсолютного количественного определения, тогда как третий обычно используется для

относительная количественная оценка. Эталонный ген - это ген, уровень экспрессии которого постоянен

во всех тестовых образцах и на выражение которых не влияют экспериментальные

изучаемое лечение. Использование эталонного гена выгодно в случаях

где точное количественное определение количества входной РНК невозможно, например, в

случаи, когда доступно только небольшое количество стартового шаблона.

Страница 39

анализ данных КПЦР в реальном времени

абсолютное количественное определение

Доступно множество различных методов для выполнения как абсолютных, так и относительных

Количественное. В следующих нескольких разделах мы приводим примеры и рекомендации

когда и как использовать методы абсолютной и относительной количественной оценки, и

продолжить изучение концепции нормализатора применительно к каждому из двух

количественные стратегии.

4.1 Абсолютная количественная оценка