Флуоресцентная химия на основе праймеров и зондов

Было разработано много химикатов на основе флуоресцентных праймеров и зондов, и

доступны от разных коммерческих поставщиков. Наиболее часто используемый зонд-

основанные на химии, TaqMan зонды и молекулярные маяки, подробно обсуждаются

ниже. Краткое описание других химикатов на основе флуоресцентных праймеров и зондов,

включая зонды Eclipse и праймеры Amplifluor, Scorpions, LUX и BD QZyme,

также представлены ниже.

Химические средства обнаружения на основе праймеров и зондов имеют некоторые общие черты.

Как правило, эти химические вещества используют энергию резонанса флуоресценции

перенос (FRET) или какая-либо другая форма гашения флуоресценции, чтобы гарантировать, что

специфическая флуоресценция обнаруживается только в присутствии амплифицированного продукта.

Праймер или специфичный для мишени олигонуклеотидный зонд помечен репортером

флуорофор; но в большинстве случаев олигонуклеотид сконструирован так, чтобы

флуоресценция гасится, когда конкретная цель недоступна. Обычно это

достигается путем присоединения молекулы-гасителя к зонду и разработки некоторых

механизм, с помощью которого репортер и гаситель разделены, когда зонд

привязывается к своей конкретной цели. Детали того, как каждая химия достигает этого

Разделение будет описано в следующих разделах.

В ПЦР в реальном времени флуоресцентные праймеры и зонды имеют два основных преимущества

поверх ДНК-связывающих красителей. Во-первых, они специально обнаруживают целевую последовательность так,

Неспецифические продукты не влияют на точность количественного определения. Во-вторых, они

позволяют выполнять мультиплексные реакции.

TaqMan Assays

В анализах TaqMan используется специфичный по последовательности флуоресцентно меченный олигонуклеотид

зонд, называемый зондом TaqMan, в дополнение к специфичным для последовательности праймерам.

Рисунок 2.3 иллюстрирует, как работают анализы TaqMan. Также известен как 5'-нуклеаза

В анализе TaqMan используется 5'-экзонуклеазная активность некоторых

термостабильные полимеразы, такие как Taq или Tth. Зонд содержит флуоресцентный

репортер на 5 'конце и гаситель на 3' конце. Когда нетронутой, флуоресценция

репортера гасят из-за его близости к гасителю. Вовремя

объединенная стадия отжига / удлинения реакции амплификации, зонд

гибридизуется с мишенью и dsDNA-специфичной 5 '-> 3' экзонуклеазной активностью

Taq или Tth отщепляется от репортера. В результате репортер отделен от

гаситель, и полученный сигнал флуоресценции пропорционален количеству

амплифицированный продукт в образце. Один обычно используемый флуоресцентный репортер-

Гаситель пара флуоресцеин (FAM, который испускает зеленую флуоресценцию) и черный

Гаситель отверстий 1. Для получения дополнительной информации о подходящих парах репортер-гаситель см.

Таблица 2.1.

Основные преимущества использования зондов TaqMan включают высокую специфичность, высокую

отношение сигнал / шум и способность выполнять мультиплексные реакции.

Недостатки в том, что первоначальная стоимость зонда может быть высокой, и анализ

дизайн не может быть тривиальным. См. Раздел 2.4.1 для получения подробной информации о дизайне анализа TaqMan.

Страница 17

начиная

соображения экспериментального дизайна

Молекулярные Маяки

В дополнение к двум специфичным для последовательности праймерам в молекулярно-маяковых анализах используется

специфичный к последовательности флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, называемый молекулярным

маяк, который представляет собой меченый красителем олигонуклеотид (25–40 нт), который образует шпильку

структура со стеблем и петлей (рисунок 2.4). Флуоресцентный репортер прикреплен к

5 'конец молекулярного маяка и гаситель присоединен к 3' концу.

петля предназначена для специфической гибридизации с 15–30 нуклеотидными срезами мишени

последовательность. По обе стороны от петли 5-6 нт, которые компл е тарные друг

другой, и образуют структуру ствола, которая служит для того, чтобы доставить репортера и гасителя

вместе. В структуре шпильки у репортера не обнаружено флуоресценции

из-за его физической близости к гасителю. На этапе отжига

В реакции амплификации молекулярный маяк связывается со своей последовательностью-мишенью,

разделение репортера и гасителя таким образом, чтобы репортер больше не гасился.

В отличие от анализов TaqMan, молекулярные маяки перемещаются, но не разрушаются во время

амплификации, потому что ДНК-полимераза, лишенная 5'-экзонуклеазной активности, является

используемый. Количество флуоресценции, испускаемой репортером на молекулярном маяке

пропорционально количеству мишени в реакции.

Молекулярные маяки имеют некоторые преимущества перед другими химическими препаратами. Они очень

конкретный, может использоваться для мультиплексирования, и если целевая последовательность не совпадает

последовательности маяка, гибридизации и флуоресценции не произойдет -

желательное качество для экспериментов аллельной дискриминации.

Основной недостаток использования молекулярных маяков заключается в их конструкции. Стебель

шпилька должна быть достаточно прочной, чтобы молекула не спонтанно складывалась

в не шпильки конформации, которые приводят к непреднамеренной флуоресценции. В то же

время, стержень шпильки не должен быть слишком сильным, или маяк не может

правильно гибридизировать с целью.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

13

Рис. 2.3. Анализ TaqMan.

репортер

расширение

гаситель

р

Q

р

Q

р

Q

р

Q

Во время отжига зонд TaqMan связывается с

последовательность целей

Во время удлинения зонд частично смещен

и репортер раскололся. Бесплатный репортер

флуоресцирует

Страница 18

Другие химии

Гибридизационные зондовые анализы используют два специфичных для последовательности олигонуклеотида

зонды, в дополнение к двум специфичным для последовательности праймерам. Два зонда предназначены

связать с соседними последовательностями в цели, как показано на рисунке 2.5. Первый

зонд несет донорный краситель на своем 3'-конце, в то время как второй несет акцепторный краситель на

его 5 'конец. Донорный и акцепторный красители выбираются таким образом, чтобы излучение

спектр донорного красителя существенно перекрывается со спектром возбуждения

акцепторный краситель, в то время как спектр излучения донорного красителя спектрально разделен

из спектра излучения акцепторного красителя. Возбуждение осуществляется при

длина волны специфична для донорного красителя, а реакция контролируется на излучение

длина волны акцепторного красителя. На стадии отжига ПЦР зонды

гибридизуются с их целевыми последовательностями в расположении головы к хвосту. Это приносит

флуоресцентные молекулы в непосредственной близости, что позволяет энергии резонанса флуоресценции

перевод от донора к акцептору. Увеличение количества акцепторной флуоресценции

пропорционально количеству присутствующего ампликона.

начиная

соображения экспериментального дизайна

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

14

репортер

гаситель

р

Q

р

Q

Во время отжига зонд связывается с

целевая последовательность для отделения репортера и

гаситель. Репортер флуоресцирует

Молекулярные маяки - это шпильки-зонды с

репортер и гаситель

р

Q

Рис. 2.4. Молекулярные маяки.

Донорский флуорофор

Акцепторный флуорофор

R2

R2

R1

R1

R2

R1

Во время отжига два зонда связываются

к цели в направлении головы к хвосту.

Акцепторный флуорофор флуоресцирует

Рис. 2.5. Гибридизационные зонды.

Страница 19

начиная

соображения экспериментального дизайна

Анализы КПЦР с использованием зонда Eclipse используют два праймера и последовательность-

специфический олигонуклеотидный зонд, как показано на рисунке 2.6. Зонд

дополняет последовательность внутри ампликона и содержит флуоресцентный

репортер на 3'-конце, гаситель на 5'-конце и небольшая связующая канавка.

Негибридизированный зонд принимает конформацию, которая приносит репортеру и

гасим вместе, гасим репортера. На этапе отжига ПЦР,

зонд гибридизуется с мишенью с помощью связующего вещества с малой канавкой.

Таким образом, зонд становится линеаризованным, разделяя репортер и гаситель и

позволяя репортеру флуоресцировать. Результирующий флуоресцентный сигнал пропорционален

количество амплифицированного продукта в образце.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

15

Рис. 2.6. Затмение зондов.

репортер

гаситель

Незначительная канавка

р

Q

р

Q

Во время отжига зонд разворачивается и связывается

к целевой последовательности, чтобы отделить репортера

и гаситель. Репортер флуоресцирует

В неповрежденном зонде Eclipse репортер

гасится в непосредственной близости от гасителя

р

Q

MGB

MG

В

3'

5'

MG

В

В анализах КПЦР с использованием химии Amplifluor используются два специфичных для мишени праймера и

один универсальный учебник под названием UniPrimer. Первый целевой специфический праймер содержит

5 'последовательность расширения, называемая Z-последовательностью, которая также находится на 3' конце

UniPrimer. Как показано на рисунке 2.7, UniPrimer образует шпилечную структуру.

Флуоресцентный репортер и гаситель прикреплены на 5 'и 3' концах

стволовая структура соответственно. В конформации шпильки, репортер флуоресценции

гасится из-за своей близости к гасителю. Во время первого цикла амплификации

первый целевой специфический праймер (с Z-последовательностью) гибридизуется с матрицей

и продлен. Во время второго цикла амплификации второй целевой

праймер используется для синтеза нового целевого шаблона, который содержит последовательность

дополняет Z-последовательность. Продукт со второго усиления

цикл может служить шаблоном для UniPrimer. В третьем усилении

цикл, расширенный UniPrimer служит шаблоном для следующего цикла амплификации.

В четвертом цикле расширение шаблона через область шпильки

UniPrimer заставляет UniPrimer открываться и принимать линейную конфигурацию,

Страница 20

что позволяет репортеру флуоресцировать. Экспоненциальное усиление с использованием второго

специфичный для мишени праймер и UniPrimer происходит в последующих циклах амплификации.

Результирующий флуоресцентный сигнал пропорционален количеству амплифицированного продукта в

образец.

В анализе праймеров Scorpions используются два праймера, один из которых служит в качестве зонда.

и содержит структуру петли стебля с 5 'флуоресцентным репортером и 3' гасителем,

как показано на рисунке 2.8. Последовательность петли зонда Scorpions:

комплементарен внутренней части последовательности-мишени на той же цепи.

Во время первого цикла амплификации праймер Scorpions удлиняется и

последовательность, комплементарная последовательности петли, генерируется на той же цепи.

Зонд Scorpions содержит блокатор ПЦР всего в 3 'от гасителя, чтобы предотвратить

Прочитать во время расширения противоположной нити. После последующего

денатурации и отжига, петля зонда Scorpions гибридизуется с

последовательность-мишень путем внутримолекулярного взаимодействия, и репортер отделяется

из гасителя. Результирующий флуоресцентный сигнал пропорционален количеству

амплифицированного продукта в образце.

При анализе праймеров LUX используются два праймера, один из которых представляет собой праймер в форме шпильки

с флуоресцентным репортером, прикрепленным около 3 'конца, как показано на рисунке 2.9.

В неповрежденном праймере репортер гасится вторичной структурой

шпилька. Во время амплификации праймер LUX включается в продукт и

репортер флуоресцирует.

начиная

соображения экспериментального дизайна

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

16

репортер

гаситель

р

Q

UniPrimer отжигает последовательность

праймера Z и продлен

полимеразной

UniPrimer-содержащий продукт служит

в качестве шаблона для другого учебника

Удлинение праймера вызывает заколку

развернуть и отделить репортера и

гаситель. Репортер флуоресцирует

Z-праймер отжигает и расширяется в

первый раунд усиления

р

Q

3'

Z

Z

5'

р

Q

р

Q

Рис. 2.7. Amplifluor грунтовка.

Страница 21

начиная

соображения экспериментального дизайна

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

17

репортер

Блокатор ПЦР

гаситель

р

Q

Во время отжига шпилька-грунтовка связывает

к шаблону, а затем расширяется

Праймер Scorpions действует как зонд.

Неповрежденный праймер образует шпильку, так что

закаленный репортер не флуоресцирует

Во время последующей денатурации, репортер

отделяется от гасителя, и цикл

последовательность связывается с внутренней целевой последовательностью.

Репортер на расширенной грунтовке Scorpions

флуоресцирует

р

Q

р

Q

р

Q

Рис. 2.8. Скорпион праймер.

Рис. 2.9. Праймеры LUX.

репортер

расширение

отжиг

денатурация

р

Праймер LUX образует шпильку, чтобы

закаленный репортер не флуоресцирует

Грунтовка становится одноцепочечной

Во время расширения праймер расширяется, и

репортер флуоресцирует в двухцепочечной

Продукт ДНК

р

р

р

р

Страница 22

начиная

соображения экспериментального дизайна

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

18

Анализы КПЦР с использованием праймеров BD QZyme используют специфичный для мишени зимоген.

праймер, специфичный для мишени обратный праймер и универсальный олигонуклеотидный субстрат в виде

показано на рисунке 2.10. Олигонуклеотид содержит флуоресцентный репортер на

5 'конец и гаситель на 3' конце. Когда олигонуклеотидный субстрат не поврежден,

Флуоресценция репортера гасится гасителем из-за их близости.

Зимогенный праймер содержит последовательность, которая кодирует каталитическую ДНК. В течение

В первом цикле амплификации зимогенный праймер удлиняется. Во втором цикле

продукт первого цикла используется в качестве шаблона для целевого обратного

праймер, который расширяется для создания новой последовательности-мишени, содержащей каталитическую

Область ДНК. На последующем этапе отжига флуоресцентно меченный

Олигонуклеотидный субстрат гибридизуется с каталитической последовательностью ДНК и расщепляется.

Это расщепление отделяет репортер от гасителя, что приводит к флуоресценции

сигнал, который пропорционален количеству амплифицированного продукта в образце.

расширение

Зимогенный праймер кодирует

каталитическая ДНК. Во время отжига

зимогенный праймер отжигает до мишени

Во время расширения каталитический

ДНК сделана

Во время следующего этапа отжига

каталитическая ДНК связывает зонд и

отщепляет репортера от гасителя

Свободный репортер флуоресцирует

денатурация

Отжиг зонда

р

Q

р

Q

репортер

гаситель

р

Q

Рис. 2.10. Праймеры BD QZyme.

Страница 23

начиная

разработка и оптимизация реакций SYBR Green I

2.3 Разработка и оптимизация

SYBR Green I Реакции

В анализе SYBR Green I используется пара ПЦР-праймеров, которые амплифицируют конкретную область

в целевой последовательности интерес и включает SYBR Green 1 для обнаружения

амплифицированный продукт. Шаги для разработки анализа SYBR Green I:

• Дизайн грунтовки и дизайн ампликона

• Проверка достоверности и оптимизация

В разделах 2.3.1 и 2.3.2 приведены рекомендации по выполнению этих двух шагов.