Когда следует использовать относительную количественную оценку?

Теперь давайте рассмотрим пример, который требует относительной количественной оценки. Исследователь

хочет знать, отличается ли уровень экспрессии р53 от раковой и

нормальные клетки яичников, и если да, то насколько. Он хочет выяснить родственника

количество, иногда называемое «кратной разницей», мРНК р53 в эквиваленте

количество двух тканей. Исследователь может выбрать один из следующих

экспериментальные проекты в зависимости от типа нормализатора, который он хочет использовать:

(1) Исследователь извлекает РНК из 1000 раковых и 1000 нормальных яичников

клеток, и определяет количество мРНК р53 в образцах, запустив

анализ обратной транскрипции (RT) КПЦР, специфичный для мРНК р53. Исследователь тогда

узнает относительную кратность разницы мРНК р53, взяв соотношение числа

молекул мРНК р53 в образцах РНК из эквивалентного числа раковых

и нормальные клетки яичников.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

37

Таблица 4.1. Определение абсолютного количества копий β-актина у неизвестного

образцы А и В с использованием метода абсолютного количественного определения. Уравнение

Линия линейной регрессии, показанная на рисунке 4.1, была использована для расчета копии

количество неизвестных образцов.

Образец

Повторные

C T

Копии

A

1

18,61

204577

A

2

18,41

234115

A

3

18,87

172300

Средний

203664 ± 30,917

В

1

17,06

569789

В

2

17,07

563823

В

3

17,00

591173

Средний

574 928 ± 14 381

Страница 42

анализ данных КПЦР в реальном времени

относительная количественная оценка

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

38

(2) Если исследователь ранее определил, что уровень мРНК GAPDH

Экспрессия идентична в раковых и нормальных клетках, исследователь может извлечь

РНК из приблизительно эквивалентного количества раковых и нормальных яичников

клетки без определения точного количества клеток. Уровень мРНК р53 и

МРНК GAPDH в образцах затем определяли анализом RT-КПЦР.

Относительную экспрессию р53 в раковых и нормальных клетках определяли, принимая

соотношение нормализованной по GAPDH экспрессии p53 в двух разных типах клеток.

В приведенном выше примере относительное количественное определение было выбрано потому, что исследователь

интересовало относительное количество целевой нуклеиновой кислоты в эквивалентных количествах

образцов А и В. Разница между двумя описанными методами анализа

выше тип нормализатора используется. В первом сценарии нормализатор является

количество клеток. Во втором сценарии нормализатором является мРНК GAPDH

уровень экспрессии, который ранее был определен как постоянный между

два типа клеток. Математические манипуляции для двух сценариев

представлены в разделах 4.2.2 и 4.2.3 соответственно. В обоих случаях конечный результат

является количественным описанием некоторого свойства одного образца относительно того же

свойство другого образца. Другими словами, используйте относительную количественную оценку для сравнения

конкретное свойство между несколькими образцами.

Относительная количественная оценка, нормализованная по отношению к

Единица массы

Преимущества использования единичной массы (например, количества клеток или мкг нуклеиновой кислоты)

а не эталонный ген в качестве нормализатора в том, что экспериментальный дизайн

концептуально прост, а математическая обработка проста.

Метод требует точного количественного определения исходного материала, независимо от

ли количество клеток или мкг нуклеиновой кислоты используется в качестве нормализатора.

При сравнении нескольких образцов с использованием относительного количественного анализа, один образец

обычно выбирается в качестве калибратора (иногда его называют контрольным образцом),

и экспрессия целевого гена во всех других образцах выражается как

увеличить или уменьшить относительно калибратора. Обычно, необработанные или

Исходный образец выбран в качестве калибратора. В случае примера p53,

мы можем выбрать нормальные клетки яичников в качестве калибратора и раковых

клетки яичников в качестве тестового образца.

Страница 43

анализ данных КПЦР в реальном времени

относительная количественная оценка

Определить относительную экспрессию р53 в раковых и нормальных яичниках

клетки, общую РНК готовили из равного количества нормальных клеток яичника и

раковые клетки яичников. Значения C T для тестируемого образца (раковые клетки) и

Образец калибратора (нормальные клетки) затем использовали для расчета соотношения между

два по следующему уравнению:

Соотношение (тест / калибратор) = E C T (калибратор) - C T (тест)

E - эффективность реакции и может быть определена, как описано в разделе

1.1.3. Если мы предположим, что анализ имеет идеальную эффективность амплификации (то есть

шаблон удваивается в каждом цикле амплификации), тогда уравнение выше становится:

Соотношение (тест / калибратор) = 2 C T (калибратор) - C T (тест)

или

Соотношение (тест / калибратор) = 2 ∆C T

где ΔC T = C T (калибратор) - C T (испытание)

Этот метод для вычисления относительного выражения часто называют ΔC T

метод. Ниже приведен гипотетический пример, демонстрирующий, как ΔC T

Метод может быть использован для определения относительной экспрессии целевого гена (р53) в

раковые и нормальные клетки яичников.

Пример: кДНК, представляющая 50 нг общей РНК, выделенной как из нормальной, так и из

клетки опухоли яичника анализировали на предмет сообщения р53. Значения C T для каждого образца

показаны ниже:

Образец

C T для р53 (цель)

Нормальный (калибратор)

15,0

Опухоль (тест)

12,0

Предполагая 100% эффективность амплификации (E = 2), и выбирая нормальные клетки в качестве

калибратор, относительная экспрессия экспрессии р53 в раковых и нормальных

Клетки яичника рассчитывается следующим образом:

Соотношение (тест / калибратор) = 2 C T (калибратор) - C T (тест)

= 2 (15 - 12)

= 8

Следовательно, экспрессия р53 в опухолевых клетках в 8 раз выше, чем в норме.

клетки яичников.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

39

Страница 44

анализ данных КПЦР в реальном времени

относительная количественная оценка

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

40