Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ:  Археология Биология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия ЭкологияТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву 
Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Обзор ПЦР в реальном времениСтр 1 из 20Следующая ⇒
ПЦР в реальном времени Руководство по применению
содержание оглавление я Содержание Обзор ПЦР в реальном времени 2 1.1 Ключевые понятия ПЦР в реальном времени 2 1.1.1 Что такое ПЦР в реальном времени? 2 1.1.2 Как работает ПЦР в реальном времени 3 1.1.3 Отличительные признаки оптимизированного анализа КПЦР 4 Начало работы 8 2.1 Общие соображения 8 2.2 Экспериментальные соображения по проектированию КПЦР 9 2.2.1 Singleplex или Multiplex? 9 2.2.2 Выбор химии 9 2.2.2.1 ДНК-связывающие красители (SYBR Green I) 10 2.2.2.2 Флуоресцентная химия на основе праймеров и зондов 12 2.3 Разработка и оптимизация реакций SYBR Green I 19 2.3.1. Проектирование праймеров и ампликонов 19 2.3.2 Проверка достоверности и оптимизация 20 2.3.2.1 Оптимизация температуры отжига 20 2.3.2.2 Оценка эффективности анализа с использованием стандартных кривых 22 2.4. Разработка и оптимизация зондовых реакций TaqMan. 23 2.4.1 Дизайн грунтовки и зонда 23 2.4.2 Проверка достоверности и оптимизация 24 Вопросы мультиплексирования 28 3.1 Учебник для начинающих и зондов для мультиплексирования 28 3.2 Выбор репортеров и гасителей для мультиплексирования 29 3.3 Оптимизация индивидуальных анализов перед мультиплексированием 29 3.4 Валидация мультиплексных анализов 29 3.5 Оптимизация мультиплексных анализов 30
содержание оглавление ii Анализ данных КПЦР в реальном времени 34 4.1 Абсолютная количественная оценка 35 4.1.1. Когда следует использовать абсолютное количественное определение? 35 4.1.2 Абсолютное количественное определение с использованием стандартной кривой 35 4.2 Относительная количественная оценка 37 4.2.1 Когда следует использовать относительную количественную оценку? 37 4.2.2 Относительная количественная оценка, нормализованная по отношению к единице массы 38 4.2.3 Относительная количественная оценка, нормализованная к эталонному гену 40 4.2.3.1 2 –AAC Метод Т (Ливак) 41 4.2.3.2 Метод AC T с использованием эталонного гена 42 4.2.3.3 Метод Пфаффля 43 Анализ экспрессии генов 46 5.1 Экспериментальный дизайн 46 5.2 Изоляция РНК 47 5.2.1 Сбор образцов 47 5.2.2 Экстракция РНК 48 5.2.3 Анализ количества и качества нуклеиновой кислоты 48 5.3 Подготовка матрицы кДНК (обратная транскрипция)
49 5.4 Разработка анализа КПЦР 50 5.5 Эксперименты 51 5.5.1 Реакционные компоненты для мультиплексного анализа 51 5.5.2 Протокол езды на велосипеде 51 5.6 Анализ данных генной экспрессии 52 Генотипирование / аллельная дискриминация 54 6.1 Экспериментальный дизайн 55 6.2 Разработка грунтовки и зонда с использованием зондов TaqMan 56 6.3 Экстракция ДНК и подготовка образца 57 6.4 Компоненты реакции при использовании зондов TaqMan 58 6.5 Оптимизация 59 6.6 Протокол езды на велосипеде с использованием TaqMan Probes 59 6.7 Анализ данных аллельной дискриминации 59 6.7.1 Проверка достоверности анализа аллельной дискриминации 59 6.7.2 Присвоение генотипа 72
Обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО) 76 7.1 Экспериментальный дизайн 77 7.2 Экстракция ДНК и подготовка образца для обнаружения ГМО 77 7.3. Обнаружение ГМ-сои с использованием однократного анализа SYBR Green I qPCR 78 7.3.1 Компоненты реакции 78 7.3.2 Протокол езды на велосипеде 79 7.3.3 Анализ данных 79 7.4 Обнаружение ГМ-сои с использованием мультиплексного анализа TaqMan qPCR 81 7.4.1 Компоненты реакции 82 7.4.2 Протокол езды на велосипеде 82 7.4.3 Анализ данных 82 Руководство по продукту 85 содержание оглавление iii
Обзор ПЦР в реальном времени Общие Соображения 8 Вопросы экспериментального проектирования для КПЦР 9 Singleplex или Multiplex? 9 Выбор химии 9 ДНК-связывающие красители (SYBR Green I) 10 Флуоресцентная химия на основе праймеров и зондов 12 Разработка и оптимизация реакций SYBR Green I 19 Праймер и Ампликон Дизайн 19 Проверка правильности и оптимизация 20 Оптимизация температуры отжига 20 Оценка эффективности анализа с использованием стандартных кривых 22 Singleplex или Multiplex? Как практические, так и научные причины могут заставить вас попробовать мультиплексирование, усиление более чем одной мишени в одной реакционной пробирке. В настоящее время это возможно усиление и количественное определение до пяти целей в одной пробирке, в зависимости от на функции вашего инструмента ПЦР в реальном времени. Мультиплексирование дает следующее
Преимущества перед одноплексными реакциями: • Сокращение количества необходимого стартового шаблона, что важно при количество исходного материала ограничено • Уменьшение количества ложных негативов, если контрольная цель усиливается в каждом образце • Увеличение производительности лаборатории с сопутствующим снижением затрат на реагенты • Минимизация обработки проб и связанные с этим возможности для лаборатории загрязнение Если ни одно из этих соображений не имеет значения для ваших анализов, то используйте однократный реакции достаточно. Практические советы о том, как настроить и оптимизировать мультиплекс Реакции КПЦР приведены в разделе 3. Выбор химии Ключевым шагом в разработке анализа КПЦР является выбор химического состава для мониторинга амплификация последовательности-мишени. Разнообразие флуоресцентных химикатов доступно можно разделить на два основных типа: 1) ДНК-связывающие красители (SYBR Green I), и 2) меченые красителем, специфичные для последовательности олигонуклеотидные праймеры или зонды (молекулярные Beacons и TaqMan, гибридизация и Eclipse-зонды, и Amplifluor, Scorpions, Праймеры LUX и BD QZyme). Наиболее часто используемые химические препараты для ПЦР в реальном времени ДНК-связывающие красители SYBR Green I и TaqMan для гидролиза. Мы предоставляем обзор этих различных типов флуоресцентных химикатов в разделах 2.2.2.1–2.2.2.2. © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 9
начиная соображения экспериментального дизайна © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 10 Химический состав, выбранный вами для анализа КПЦР, зависит от вашего применения, выполняете ли вы одноплексные или мультиплексные реакции, и соображения стоимости. Как правило, для одноплексных экспериментов с низкой пропускной способностью ДНК-связывающие красители могут быть предпочтительнее, потому что эти анализы легче спроектировать, быстрее настроить и изначально более экономически эффективны. Для экспериментов с высокой пропускной способностью, однако, Анализ на основе флуоресцентного праймера или зонда (одноплексный или мультиплексный) может быть более желательно, потому что первоначальная стоимость может быть распространена на многие эксперименты и Возможность мультиплексирования может сократить время анализа. Мультиплексные анализы требуют использования химия на основе флуоресцентных праймеров или зондов, потому что отсутствие специфичности ДНК-связывающие красители делают их несовместимыми с количественными мультиплексными анализами. ПЦР Unbound SYBR Зеленый I Связанный SYBR Green I Рис. 2.1. ДНК-связывающие красители в ПЦР в реальном времени. Флуоресценция резко возрастает, когда краситель молекулы связываются с дцДНК.
начиная соображения экспериментального дизайна © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 11 Рис. 2.2. Анализ кривой плавления продукта реакции из анализа SYBR Green I. Анализ кривой плавления Функция инструментов реального времени может использоваться для различения конкретных продуктов от неспецифических продуктов. А. Отрицательная первая производная изменения флуоресценции представлена в виде функции температуры.
Два пика указывают значения T m двух продуктов ПЦР. Б. Гель-анализ продуктов КПЦР. Дорожка 1, молекулярная линейка AmpliSize ® 50–2000 пар оснований (bp); дорожки 2 и 3, две копии КПЦР продукт реакции, показанный в (А). Два продукта ПЦР выявляются отдельными полосами в геле. A В Преимущества использования дсДНК-связывающих красителей включают простую конструкцию анализа (требуется только два праймера; дизайн зонда не требуется), возможность тестирования нескольких гены быстро без разработки нескольких зондов (например, для проверки гена данные экспрессии от многих генов в эксперименте с микрочипами), более низкая начальная стоимость (датчики стоят дороже), а также возможность выполнить анализ кривой плавления для проверки Специфика реакции амплификации. Анализ кривой плавления может быть использован для идентификации различных продуктов реакции, в том числе Неспецифические продукты. После завершения реакции амплификации кривая расплава генерируется путем увеличения температуры с небольшими приращениями и мониторинга флуоресцентный сигнал на каждом шаге. Как дцДНК в реакции денатурирует (т. Е. Как ДНК «плавится»), флуоресценция уменьшается. Первая отрицательная производная изменение флуоресценции наносится на график как функция температуры. Характеристика пик при температуре плавления ампликона (Т м, температура, при которой 50% пары оснований дуплекса ДНК разделены) отличает его от других продуктов такие как праймеры-димеры, которые плавятся при разных температурах. Примером этого показано на рисунке 2.2. Пик расплава с Т м 89 ° С представляет собой удельный продукта, и соответствует верхней полосе на дорожках 2 и 3 на геле. Пик с Т м 78 ° С представляет собой неспецифический продукт и соответствует нижняя полоса на дорожках 2 и 3 на геле. Основным недостатком ДНК-связывающих красителей является их отсутствие специфичности, то есть ДНК-связывающие красители связываются с любой дцДНК. В результате наличие неспецифического продукты в реакции ПЦР в реальном времени могут способствовать общей флуоресценции и влияет на точность количественного определения. Другим следствием является то, что ДНК-связывание красители не могут быть использованы для мультиплексных реакций, потому что флуоресцентные сигналы от
разные ампликоны не различимы. Вместо этого вы можете настроить параллельное реакции для изучения нескольких генов, таких как ген интереса и ссылки ген, в ПЦР-анализе в реальном времени с SYBR Green I.
начиная соображения экспериментального дизайна © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 12 TaqMan Assays В анализах TaqMan используется специфичный по последовательности флуоресцентно меченный олигонуклеотид зонд, называемый зондом TaqMan, в дополнение к специфичным для последовательности праймерам. Рисунок 2.3 иллюстрирует, как работают анализы TaqMan. Также известен как 5'-нуклеаза В анализе TaqMan используется 5'-экзонуклеазная активность некоторых термостабильные полимеразы, такие как Taq или Tth. Зонд содержит флуоресцентный репортер на 5 'конце и гаситель на 3' конце. Когда нетронутой, флуоресценция репортера гасят из-за его близости к гасителю. Вовремя объединенная стадия отжига / удлинения реакции амплификации, зонд гибридизуется с мишенью и dsDNA-специфичной 5 '-> 3' экзонуклеазной активностью Taq или Tth отщепляется от репортера. В результате репортер отделен от гаситель, и полученный сигнал флуоресценции пропорционален количеству амплифицированный продукт в образце. Один обычно используемый флуоресцентный репортер- Гаситель пара флуоресцеин (FAM, который испускает зеленую флуоресценцию) и черный Гаситель отверстий 1. Для получения дополнительной информации о подходящих парах репортер-гаситель см. Таблица 2.1. Основные преимущества использования зондов TaqMan включают высокую специфичность, высокую отношение сигнал / шум и способность выполнять мультиплексные реакции. Недостатки в том, что первоначальная стоимость зонда может быть высокой, и анализ дизайн не может быть тривиальным. См. Раздел 2.4.1 для получения подробной информации о дизайне анализа TaqMan.
начиная соображения экспериментального дизайна Молекулярные Маяки В дополнение к двум специфичным для последовательности праймерам в молекулярно-маяковых анализах используется специфичный к последовательности флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, называемый молекулярным маяк, который представляет собой меченый красителем олигонуклеотид (25–40 нт), который образует шпильку структура со стеблем и петлей (рисунок 2.4). Флуоресцентный репортер прикреплен к 5 'конец молекулярного маяка и гаситель присоединен к 3' концу. петля предназначена для специфической гибридизации с 15–30 нуклеотидными срезами мишени последовательность. По обе стороны от петли 5-6 нт, которые компл е тарные друг другой, и образуют структуру ствола, которая служит для того, чтобы доставить репортера и гасителя вместе. В структуре шпильки у репортера не обнаружено флуоресценции из-за его физической близости к гасителю. На этапе отжига В реакции амплификации молекулярный маяк связывается со своей последовательностью-мишенью,
разделение репортера и гасителя таким образом, чтобы репортер больше не гасился. В отличие от анализов TaqMan, молекулярные маяки перемещаются, но не разрушаются во время амплификации, потому что ДНК-полимераза, лишенная 5'-экзонуклеазной активности, является используемый. Количество флуоресценции, испускаемой репортером на молекулярном маяке пропорционально количеству мишени в реакции. Молекулярные маяки имеют некоторые преимущества перед другими химическими препаратами. Они очень конкретный, может использоваться для мультиплексирования, и если целевая последовательность не совпадает последовательности маяка, гибридизации и флуоресценции не произойдет - желательное качество для экспериментов аллельной дискриминации. Основной недостаток использования молекулярных маяков заключается в их конструкции. Стебель шпилька должна быть достаточно прочной, чтобы молекула не спонтанно складывалась в не шпильки конформации, которые приводят к непреднамеренной флуоресценции. В то же время, стержень шпильки не должен быть слишком сильным, или маяк не может правильно гибридизировать с целью. © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 13 Рис. 2.3. Анализ TaqMan. репортер расширение гаситель р Q р Q р Q р Q Во время отжига зонд TaqMan связывается с последовательность целей Во время удлинения зонд частично смещен и репортер раскололся. Бесплатный репортер флуоресцирует
Другие химии Гибридизационные зондовые анализы используют два специфичных для последовательности олигонуклеотида зонды, в дополнение к двум специфичным для последовательности праймерам. Два зонда предназначены связать с соседними последовательностями в цели, как показано на рисунке 2.5. Первый зонд несет донорный краситель на своем 3'-конце, в то время как второй несет акцепторный краситель на его 5 'конец. Донорный и акцепторный красители выбираются таким образом, чтобы излучение спектр донорного красителя существенно перекрывается со спектром возбуждения акцепторный краситель, в то время как спектр излучения донорного красителя спектрально разделен из спектра излучения акцепторного красителя. Возбуждение осуществляется при длина волны специфична для донорного красителя, а реакция контролируется на излучение длина волны акцепторного красителя. На стадии отжига ПЦР зонды гибридизуются с их целевыми последовательностями в расположении головы к хвосту. Это приносит флуоресцентные молекулы в непосредственной близости, что позволяет энергии резонанса флуоресценции перевод от донора к акцептору. Увеличение количества акцепторной флуоресценции пропорционально количеству присутствующего ампликона. начиная соображения экспериментального дизайна © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 14 репортер гаситель р Q р Q Во время отжига зонд связывается с целевая последовательность для отделения репортера и гаситель. Репортер флуоресцирует Молекулярные маяки - это шпильки-зонды с репортер и гаситель р Q Рис. 2.4. Молекулярные маяки. Донорский флуорофор Акцепторный флуорофор R2 R2 R1 R1 R2 R1 Во время отжига два зонда связываются к цели в направлении головы к хвосту. Акцепторный флуорофор флуоресцирует Рис. 2.5. Гибридизационные зонды.
начиная соображения экспериментального дизайна Анализы КПЦР с использованием зонда Eclipse используют два праймера и последовательность- специфический олигонуклеотидный зонд, как показано на рисунке 2.6. Зонд дополняет последовательность внутри ампликона и содержит флуоресцентный репортер на 3'-конце, гаситель на 5'-конце и небольшая связующая канавка. Негибридизированный зонд принимает конформацию, которая приносит репортеру и гасим вместе, гасим репортера. На этапе отжига ПЦР, зонд гибридизуется с мишенью с помощью связующего вещества с малой канавкой. Таким образом, зонд становится линеаризованным, разделяя репортер и гаситель и позволяя репортеру флуоресцировать. Результирующий флуоресцентный сигнал пропорционален количество амплифицированного продукта в образце. © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 15 Рис. 2.6. Затмение зондов. репортер гаситель Незначительная канавка р Q р Q Во время отжига зонд разворачивается и связывается к целевой последовательности, чтобы отделить репортера и гаситель. Репортер флуоресцирует В неповрежденном зонде Eclipse репортер гасится в непосредственной близости от гасителя р Q MGB MG В 3' 5' MG В В анализах КПЦР с использованием химии Amplifluor используются два специфичных для мишени праймера и один универсальный учебник под названием UniPrimer. Первый целевой специфический праймер содержит 5 'последовательность расширения, называемая Z-последовательностью, которая также находится на 3' конце UniPrimer. Как показано на рисунке 2.7, UniPrimer образует шпилечную структуру. Флуоресцентный репортер и гаситель прикреплены на 5 'и 3' концах стволовая структура соответственно. В конформации шпильки, репортер флуоресценции гасится из-за своей близости к гасителю. Во время первого цикла амплификации первый целевой специфический праймер (с Z-последовательностью) гибридизуется с матрицей и продлен. Во время второго цикла амплификации второй целевой праймер используется для синтеза нового целевого шаблона, который содержит последовательность дополняет Z-последовательность. Продукт со второго усиления цикл может служить шаблоном для UniPrimer. В третьем усилении цикл, расширенный UniPrimer служит шаблоном для следующего цикла амплификации. В четвертом цикле расширение шаблона через область шпильки UniPrimer заставляет UniPrimer открываться и принимать линейную конфигурацию,
что позволяет репортеру флуоресцировать. Экспоненциальное усиление с использованием второго специфичный для мишени праймер и UniPrimer происходит в последующих циклах амплификации. Результирующий флуоресцентный сигнал пропорционален количеству амплифицированного продукта в образец. В анализе праймеров Scorpions используются два праймера, один из которых служит в качестве зонда. и содержит структуру петли стебля с 5 'флуоресцентным репортером и 3' гасителем, как показано на рисунке 2.8. Последовательность петли зонда Scorpions: комплементарен внутренней части последовательности-мишени на той же цепи. Во время первого цикла амплификации праймер Scorpions удлиняется и последовательность, комплементарная последовательности петли, генерируется на той же цепи. Зонд Scorpions содержит блокатор ПЦР всего в 3 'от гасителя, чтобы предотвратить Прочитать во время расширения противоположной нити. После последующего денатурации и отжига, петля зонда Scorpions гибридизуется с последовательность-мишень путем внутримолекулярного взаимодействия, и репортер отделяется из гасителя. Результирующий флуоресцентный сигнал пропорционален количеству амплифицированного продукта в образце. При анализе праймеров LUX используются два праймера, один из которых представляет собой праймер в форме шпильки с флуоресцентным репортером, прикрепленным около 3 'конца, как показано на рисунке 2.9. В неповрежденном праймере репортер гасится вторичной структурой шпилька. Во время амплификации праймер LUX включается в продукт и репортер флуоресцирует. начиная соображения экспериментального дизайна © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 16 репортер гаситель р Q UniPrimer отжигает последовательность праймера Z и продлен полимеразной UniPrimer-содержащий продукт служит в качестве шаблона для другого учебника Удлинение праймера вызывает заколку развернуть и отделить репортера и гаситель. Репортер флуоресцирует Z-праймер отжигает и расширяется в первый раунд усиления р Q 3' Z Z 5' р Q р Q Рис. 2.7. Amplifluor грунтовка.
начиная соображения экспериментального дизайна © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 17 репортер Блокатор ПЦР гаситель р Q Во время отжига шпилька-грунтовка связывает к шаблону, а затем расширяется Праймер Scorpions действует как зонд. Неповрежденный праймер образует шпильку, так что закаленный репортер не флуоресцирует Во время последующей денатурации, репортер отделяется от гасителя, и цикл последовательность связывается с внутренней целевой последовательностью. Репортер на расширенной грунтовке Scorpions флуоресцирует р Q р Q р Q Рис. 2.8. Скорпион праймер. Рис. 2.9. Праймеры LUX. репортер расширение отжиг денатурация р Праймер LUX образует шпильку, чтобы закаленный репортер не флуоресцирует Грунтовка становится одноцепочечной Во время расширения праймер расширяется, и репортер флуоресцирует в двухцепочечной Продукт ДНК р р р р
начиная соображения экспериментального дизайна © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 18 Анализы КПЦР с использованием праймеров BD QZyme используют специфичный для мишени зимоген. праймер, специфичный для мишени обратный праймер и универсальный олигонуклеотидный субстрат в виде показано на рисунке 2.10. Олигонуклеотид содержит флуоресцентный репортер на 5 'конец и гаситель на 3' конце. Когда олигонуклеотидный субстрат не поврежден, Флуоресценция репортера гасится гасителем из-за их близости. Зимогенный праймер содержит последовательность, которая кодирует каталитическую ДНК. В течение В первом цикле амплификации зимогенный праймер удлиняется. Во втором цикле продукт первого цикла используется в качестве шаблона для целевого обратного праймер, который расширяется для создания новой последовательности-мишени, содержащей каталитическую Область ДНК. На последующем этапе отжига флуоресцентно меченный Олигонуклеотидный субстрат гибридизуется с каталитической последовательностью ДНК и расщепляется. Это расщепление отделяет репортер от гасителя, что приводит к флуоресценции сигнал, который пропорционален количеству амплифицированного продукта в образце. расширение Зимогенный праймер кодирует каталитическая ДНК. Во время отжига зимогенный праймер отжигает до мишени Во время расширения каталитический ДНК сделана Во время следующего этапа отжига каталитическая ДНК связывает зонд и отщепляет репортера от гасителя Свободный репортер флуоресцирует денатурация Отжиг зонда р Q р Q репортер гаситель р Q Рис. 2.10. Праймеры BD QZyme.
начиная разработка и оптимизация реакций SYBR Green I 2.3 Разработка и оптимизация SYBR Green I Реакции В анализе SYBR Green I используется пара ПЦР-праймеров, которые амплифицируют конкретную область в целевой последовательности интерес и включает SYBR Green 1 для обнаружения амплифицированный продукт. Шаги для разработки анализа SYBR Green I: • Дизайн грунтовки и дизайн ампликона • Проверка достоверности и оптимизация В разделах 2.3.1 и 2.3.2 приведены рекомендации по выполнению этих двух шагов. Дизайн грунтовки и зонда Как и в случае любой реакции КПЦР, анализы на основе TaqMan требуют эффективных и специфических анализов. амплификация продукта. Правила оформления грунтовки аналогичны описанным в Раздел 2.3.1. Как правило, грунтовки рассчитаны на температуру отжига между 55 и 60ºC. Мы рекомендуем использовать программное обеспечение, такое как Beacon Designer для разработки ваших праймеров TaqMan и зонда TaqMan. Потому что двойная метка зонд является наиболее дорогостоящим компонентом анализа TaqMan, мы предлагаем вам заказать два праймера и проверить их эффективность с помощью SYBR Green I перед заказом зонд с двойной меткой. См. Раздел 2.3 для получения подробной информации о том, как проверить набор праймеров. в реакции SYBR Green I. Зонд TaqMan должен иметь Т м 5-10 ° С выше, чем у праймеров. В большинстве случаев зонд должен быть <30 нуклеотидов и не должен содержать G в его 5 'конец, потому что это может погасить флуоресцентный сигнал даже после гидролиза. Выберите последовательность в пределах цели, которая имеет содержание GC 30–80%, и проектировать зонд для отжига на нити, которая имеет больше Gs, чем Cs (поэтому зонд содержит больше C, чем Gs). Важным аспектом разработки зонда TaqMan является репортер и гаситель выбор. Список часто используемых комбинаций репортеров и гасителей показано в таблице 2.1. Мы рекомендуем использовать FAM-маркированные зонды при разработке одноплексные реакции, потому что они недороги и легко доступны, выполняют хорошо, и может быть обнаружен всеми инструментами, в настоящее время на рынке. © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 23
начиная разработка и оптимизация реакций зонда TaqMan © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 24 Другим важным соображением для получения точных данных КПЦР в реальном времени является зонд качества. Даже идеально разработанный зонд может выйти из строя, если зонд неправильно синтезированный или очищенный. Неправильное удаление несвязанной флуоресцентной метки, неэффективно связывание и / или плохое гашение могут давать высокий флуоресцентный фон или шум. Низкое отношение сигнал / шум приводит к снижению чувствительности и уменьшению линейный динамический диапазон. Два зонда с одинаковыми последовательностями и идентичными флуорофорные метки могут быть заметно различны при синтезе различными поставщики или даже в разное время одним и тем же поставщиком. Мы рекомендуем сохранить аликвоты каждого зонда для прямых сравнений с вновь синтезированными зондами. Репортер Совместимый гаситель FAM BHQ1, DABCYL, * TAMRA ** ТЕТ BHQ1, DABCYL * HEX BHQ1, BHQ2, DABCYL * TAMRA BHQ2, DABCYL * Техасский Красный BHQ2, BHQ3, DABCYL * ROX BHQ2, BHQ3, DABCYL * Cy5 BHQ2, BHQ3 * DABCYL - это механический гаситель, подходящий только для молекулярных маяков. ** TAMRA не рекомендуется в качестве гасителя, но будет работать для одноцветных анализов FAM. Тамра не будет хорошо работать в качестве гасителя на молекулярных маяках.
начиная разработка и оптимизация реакций зонда TaqMan Оптимизированный анализ TaqMan должен быть чувствительным и конкретным и должен демонстрировать хорошая эффективность усиления в широком динамическом диапазоне. Чтобы определить Для выполнения анализа TaqMan используйте процедуру, описанную в разделах 1.1.3. и 2.3.2. Короче говоря, построить стандартную кривую, используя разведения известного шаблона и использовать эту кривую для определения эффективности анализа наряду с R 2 или r линия регрессии. Эффективность реакции должна составлять от 90 до 105%, R 2 должен быть> 0,980 или r> | –0,990 |, и повторы должны давать аналогичные C T значения. Если анализ выполняется в соответствии с этими спецификациями, вы готовы начать эксперимент. Если анализ не соответствует этим требованиям, мы предлагаем вам перепроектируйте свои учебники для начинающих и TaqMan. Важно отметить, что диапазон концентраций матрицы, используемых для стандартная кривая должна охватывать весь диапазон концентраций матрицы тестовые образцы, чтобы продемонстрировать, что результаты тестовых образцов находятся в пределах динамический диапазон анализа. Если тестовые образцы дают результаты за пределами диапазона стандартная кривая, один из трех следующих шагов должен быть выполнен: • Построить более широкую стандартную кривую, охватывающую концентрации тестируемого образца и выполнить анализ, чтобы убедиться, что анализ является линейным в этом новом диапазоне • Если испытуемые образцы дают более низкую C T, чем самая высокая концентрация стандартов использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя разведенные образцы • Если испытуемые образцы дают более высокий C T, чем самая низкая концентрация стандартов использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя большее количество тестовые образцы © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 25
© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 26
мультиплексирование Соображения OAZ AZI ODC п С р б a s е лин е s U б тра с тэ d р F U - Singleplex, 1.25 U iTaq - Fourplex, 1.25 U iTaq - Fourplex, 2,5 U iTaq - Fourplex, 3,75 U iTaq - Fourplex, 5 U iTaq
Одним из способов оптимизации мультиплексных реакций является увеличение концентрации ДНК-полимераза, дНТФ и MgCl 2. Для оптимизации амплификации β-актина, ODC, AZI и OAZ в мультиплексной реакции, мы последовательно увеличивали концентрации ДНК-полимеразы, MgCl 2 и дНТФ. Во-первых, мы увеличили концентрацию ДНК-полимеразы iTaq в мультиплексе. реакция с шагом 1,25 единицы (U), от 1,25 U на реакцию до 5 U на реакцию. При увеличении концентрации ДНК-полимеразы мы наблюдали увеличение эффективность амплификации для ODC и AZI, как показано на рисунке 3.1. На основании этих Данные, мы решили использовать 3,75 U ДНК-полимеразы на последующих этапах оптимизации. Затем мы проверили эффект увеличения MgCl 2 с 3,5 мМ до 5 мМ и dNTPs от 200 мкМ до 400 мкМ. Как показано на рисунке 3.2, когда ДНК-полимераза iTaq концентрация была установлена на уровне 3,75 Ед на 50 мкл реакции, наш мультиплексный анализ с четырьмя генами получено 5 мМ MgCl 2 без увеличения, необходимого для dNTP. соображения мультиплексирования оптимизация мультиплексных анализов © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 31 Рис. 3.2. Оптимизация концентраций MgCl 2 и dNTP в четырехплоскостных реакциях. Сохраняя Константа концентрации iTaq ДНК-полимеразы при 3,75 U на 50 мкл реакции, влияние MgCl 2 и dNTPs концентрации были оценены. Комбинация 5,0 мМ MgCl 2, 200 мкМ dNTPs и 3,75 U iTaq ДНК Полимераза дала лучшее усиление в мультиплексных реакциях (здесь не показаны одноплексные реакции). п С р б a s е лин е s U б тра с тэ d р F U 10000 1000 100 10 1 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 β- актин 10000 1000 100 10 1 ODC 1000 100 10 1 AZI 1000 100 10 1 OAZ цикл цикл MgCl 2 дНТФ - 3,5 мМ 200 мкМ - 3,5 мМ 400 мкМ - 5,0 мМ 200 мкМ - 5,0 мМ 400 мкМ
соображения мультиплексирования optimization of multiplex assays © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 32 Рис. 3.3. Проверка эффективности мультиплексного анализа. Данные из однократного (синий) и четырехплексного (красный)
|
|||||||||||||||||||||||||||||
|
|
Последнее изменение этой страницы: 2021-04-12; просмотров: 136; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.227.102.124 (0.475 с.) |
