Проверка достоверности и оптимизация

Реакция qPCR на основе зонда TaqMan содержит следующие компоненты:

• ПЦР мастер-микс

• шаблон

• учебники для начинающих

• Зонд (ы)

Готовые смеси для ПЦР, содержащие буфер, ДНК-полимеразу и

dNTP коммерчески доступны от нескольких поставщиков. Для анализа TaqMan,

мы рекомендуем использовать супермикс iQ ™ с 300 нМ каждого из двух праймеров и

200 нМ зонда (ов).

Анализы TaqMan требуют внимательного отношения к температурным условиям. Типичный

Протокол TaqMan содержит этап денатурации с последующим комбинированным отжигом

и этап расширения при 55–60 ° C вместо традиционного трехступенчатого цикла ПЦР

денатурация, отжиг и удлинение. Это должно гарантировать, что зонд остается

связан с его целью во время расширения праймера. Типичные TaqMan-зонды для нуклеиновой кислоты

Количественная оценка рассчитана на T m 60–70 ° C.

Таблица 2.1. Обычно используются комбинации репортеров и гасителей.

Репортер

Совместимый гаситель

FAM

BHQ1, DABCYL, * TAMRA **

ТЕТ

BHQ1, DABCYL *

HEX

BHQ1, BHQ2, DABCYL *

TAMRA

BHQ2, DABCYL *

Техасский Красный

BHQ2, BHQ3, DABCYL *

ROX

BHQ2, BHQ3, DABCYL *

Cy5

BHQ2, BHQ3

* DABCYL - это механический гаситель, подходящий только для молекулярных маяков.

** TAMRA не рекомендуется в качестве гасителя, но будет работать для одноцветных анализов FAM. Тамра не будет

хорошо работать в качестве гасителя на молекулярных маяках.

Страница 29

начиная

разработка и оптимизация реакций зонда TaqMan

Оптимизированный анализ TaqMan должен быть чувствительным и конкретным и должен демонстрировать

хорошая эффективность усиления в широком динамическом диапазоне. Чтобы определить

Для выполнения анализа TaqMan используйте процедуру, описанную в разделах 1.1.3.

и 2.3.2. Короче говоря, построить стандартную кривую, используя разведения известного шаблона

и использовать эту кривую для определения эффективности анализа наряду с R 2 или r

линия регрессии. Эффективность реакции должна составлять от 90 до 105%,

R 2 должен быть> 0,980 или r> | –0,990 |, и повторы должны давать аналогичные

C T значения.

Если анализ выполняется в соответствии с этими спецификациями, вы готовы начать

эксперимент. Если анализ не соответствует этим требованиям, мы предлагаем вам

перепроектируйте свои учебники для начинающих и TaqMan.

Важно отметить, что диапазон концентраций матрицы, используемых для

стандартная кривая должна охватывать весь диапазон концентраций матрицы

тестовые образцы, чтобы продемонстрировать, что результаты тестовых образцов находятся в пределах

динамический диапазон анализа. Если тестовые образцы дают результаты за пределами диапазона

стандартная кривая, один из трех следующих шагов должен быть выполнен:

• Построить более широкую стандартную кривую, охватывающую концентрации тестируемого образца и

выполнить анализ, чтобы убедиться, что анализ является линейным в этом новом диапазоне

• Если испытуемые образцы дают более низкую C T, чем самая высокая концентрация стандартов

использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя разведенные образцы

• Если испытуемые образцы дают более высокий C T, чем самая низкая концентрация стандартов

использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя большее количество

тестовые образцы

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

25

Страница 30

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

26

Страница 31

мультиплексирование

Соображения

Дизайн грунтовки и зонда для мультиплексирования

28

Выбор репортеров и гасителей для мультиплексирования

29

Оптимизация индивидуальных анализов перед мультиплексированием

29

Валидация мультиплексных анализов

29