Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Оценка эффективности анализа с использованием стандартных кривых
Эффективность, воспроизводимость и динамический диапазон анализа SYBR Green I могут быть определяется путем построения стандартной кривой с использованием серийных разведений известного шаблон, как описано в разделе 1.1.3. Эффективность анализа должна быть 90–105%, R 2 стандартной кривой должен быть> 0,980 или r> | –0,990 |, а C T значения повторов должны быть одинаковыми. Важно отметить, что диапазон концентраций матрицы, используемых для стандартная кривая должна охватывать весь диапазон концентраций матрицы тестовые образцы, чтобы показать, что результаты тестовых образцов находятся в пределах линейного динамический диапазон анализа. Если тестовые образцы дают результаты за пределами диапазона Для стандартных кривых должно быть выполнено одно из следующих действий: • Построить более широкую стандартную кривую, охватывающую концентрации тестируемого образца и выполнить анализ, чтобы убедиться, что анализ является линейным в этом новом диапазоне • Если испытуемые образцы дают более низкую C T, чем самая высокая концентрация стандартов использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя разведенные образцы • Если испытуемые образцы дают более высокий C T, чем самая низкая концентрация стандартов использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя большее количество тестовые образцы Рис. 2.13. Анализ кривой плавления. Наличие неспецифического продукта, в данном случае праймеров-димеров, проявляется как дополнительный пик в анализе кривой плавления. А. Отрицательная первая производная от изменения Флуоресценция представлена в зависимости от температуры. Б. Гель-анализ продуктов КПЦР. Полоса 1, AmpliSize молекулярная линейка 50–2000 п.н.; дорожки 2 и 3, два повтора из реакции, показанной на (А). A В
начиная разработка и оптимизация реакций зонда TaqMan 2.4 Разработка и оптимизация TaqMan Зонд Реакции В анализе TaqMan используется пара ПЦР-праймеров и двойная метка, специфичная для мишени. флуоресцентный зонд. Шаги для разработки анализа TaqMan: • Конструкция праймера и зонда • Проверка достоверности и оптимизация В разделах 2.4.1 и 2.4.2 приведены рекомендации по выполнению этих двух шагов. Дизайн грунтовки и зонда
Как и в случае любой реакции КПЦР, анализы на основе TaqMan требуют эффективных и специфических анализов. амплификация продукта. Правила оформления грунтовки аналогичны описанным в Раздел 2.3.1. Как правило, грунтовки рассчитаны на температуру отжига между 55 и 60ºC. Мы рекомендуем использовать программное обеспечение, такое как Beacon Designer для разработки ваших праймеров TaqMan и зонда TaqMan. Потому что двойная метка зонд является наиболее дорогостоящим компонентом анализа TaqMan, мы предлагаем вам заказать два праймера и проверить их эффективность с помощью SYBR Green I перед заказом зонд с двойной меткой. См. Раздел 2.3 для получения подробной информации о том, как проверить набор праймеров. в реакции SYBR Green I. Зонд TaqMan должен иметь Т м 5-10 ° С выше, чем у праймеров. В большинстве случаев зонд должен быть <30 нуклеотидов и не должен содержать G в его 5 'конец, потому что это может погасить флуоресцентный сигнал даже после гидролиза. Выберите последовательность в пределах цели, которая имеет содержание GC 30–80%, и проектировать зонд для отжига на нити, которая имеет больше Gs, чем Cs (поэтому зонд содержит больше C, чем Gs). Важным аспектом разработки зонда TaqMan является репортер и гаситель выбор. Список часто используемых комбинаций репортеров и гасителей показано в таблице 2.1. Мы рекомендуем использовать FAM-маркированные зонды при разработке одноплексные реакции, потому что они недороги и легко доступны, выполняют хорошо, и может быть обнаружен всеми инструментами, в настоящее время на рынке. © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 23
начиная разработка и оптимизация реакций зонда TaqMan © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 24 Другим важным соображением для получения точных данных КПЦР в реальном времени является зонд качества. Даже идеально разработанный зонд может выйти из строя, если зонд неправильно синтезированный или очищенный. Неправильное удаление несвязанной флуоресцентной метки, неэффективно связывание и / или плохое гашение могут давать высокий флуоресцентный фон или
шум. Низкое отношение сигнал / шум приводит к снижению чувствительности и уменьшению линейный динамический диапазон. Два зонда с одинаковыми последовательностями и идентичными флуорофорные метки могут быть заметно различны при синтезе различными поставщики или даже в разное время одним и тем же поставщиком. Мы рекомендуем сохранить аликвоты каждого зонда для прямых сравнений с вновь синтезированными зондами.
|
||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2021-04-12; просмотров: 77; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.119.104.238 (0.008 с.) |