Абсолютное количественное определение с использованием стандартной кривой

В абсолютном выражении количество (например, номер копии или единица измерения массы)

неизвестный образец интерполируется из ряда стандартов известного количества.

Для построения стандартной кривой требуется шаблон с известной концентрацией.

Затем выполняется разведение этого шаблона, и эти разведения служат

стандарты. Неизвестные тестовые образцы анализируются с помощью стандартов в

тот же экспериментальный прогон. Стандартная кривая, построенная из разбавленного стандарта

шаблон может быть использован для определения целевого количества в неизвестном образце

путем интерполяции, аналогично использованию стандартов размера молекул для определения

молекулярный размер неизвестной полосы ДНК на агарозном геле.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

35

Страница 40

Пример использования стандартной кривой для определения количества копий конкретного

целевая нуклеиновая кислота показана на рисунке 4.1. В этом примере нас интересовало

определение количества копий гена β-актина в двух образцах А и В.

10-кратный ряд разведений был создан из образца с известной концентрацией

β-актина, в результате чего был получен набор стандартов, содержащий 10 2 –10 7 копий шаблона.

Стандарты и образцы затем анализировали в одном и том же цикле.

Была построена стандартная кривая с логарифмом начального числа копий

стандарты, нанесенные вдоль оси x, и их соответствующие значения C T, нанесенные вдоль

ось у (рисунок 4.1). Уравнение для линии линейной регрессии [y = mx + b, или

C T = m (количество бревен) + b] показано в верхней части графика.

Основываясь на уравнении для линейной регрессии, мы можем вывести следующее

Уравнение для определения количества неизвестного образца:

анализ данных КПЦР в реальном времени

абсолютное количественное определение

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

36

Рис. 4.1. Пример абсолютного количественного определения с использованием стандартной кривой. Определить номер копии

β-актина в неизвестных образцах A и B, 10-кратные разведения известной концентрации матрицы (10 2 –10 7

копии β-актина) анализировали с двумя неизвестными образцами в одном опыте с использованием анализа SYBR Green I

специфичные для β-актина. Линия регрессии от кривой разбавления была использована для определения количества копий

неизвестные образцы. Все стандартные разведения и неизвестные образцы были проанализированы в трех экземплярах на

Система обнаружения в реальном времени Chromo4.

N

N

= 10

где n = C T

н - б

(

)

м

C T - B

(

)

м

Количество бревен

у = -3,50х + 37,20; r 2 = 0,999

Образец Б

Образец А

2

3

4

5

6

7

С

T

30

25

20

15

Количество = 10

Страница 41

анализ данных КПЦР в реальном времени

относительная количественная оценка

Номера копий отдельных повторных анализов для образцов А и В были

определяется с использованием их значений C T в приведенном выше уравнении. Как правило, когда копия

отбираются пробы, сообщается среднее и стандартное отклонение отдельных проб,

как показано в последнем столбце таблицы 4.1. Важно отметить, что стандарт

Кривая может использоваться только для интерполяции, а не экстраполяции, количества неизвестного

образец. Это потому, что анализ не может быть линейным вне диапазона, охватываемого

стандарты проверены.

Распространенные приложения ПЦР в реальном времени, которые используют абсолютную количественную оценку, включают

определение числа копий хромосом или генов и определение вирусной нагрузки.

Этот метод количественного определения концептуально прост, и математика

анализ легко выполнить. Метод, однако, требует надежного источника

шаблон известной концентрации, и стандарты должны быть усилены параллельно с

образцы каждый раз, когда проводится эксперимент.

4.2 Относительная количественная оценка