Анализ данных кпцр в реальном времени

34

4.1 Абсолютная количественная оценка

35

4.1.1. Когда следует использовать абсолютное количественное определение?

35

4.1.2 Абсолютное количественное определение с использованием стандартной кривой

35

4.2 Относительная количественная оценка

37

4.2.1 Когда следует использовать относительную количественную оценку?

37

4.2.2 Относительная количественная оценка, нормализованная по отношению к единице массы

38

4.2.3 Относительная количественная оценка, нормализованная к эталонному гену

40

4.2.3.1 2 –AAC

Метод Т (Ливак)

41

4.2.3.2 Метод AC T с использованием эталонного гена

42

4.2.3.3 Метод Пфаффля

43

Анализ экспрессии генов

46

5.1 Экспериментальный дизайн

46

5.2 Изоляция РНК

47

5.2.1 Сбор образцов

47

5.2.2 Экстракция РНК

48

5.2.3 Анализ количества и качества нуклеиновой кислоты

48

5.3 Подготовка матрицы кДНК (обратная транскрипция)

49

5.4 Разработка анализа КПЦР

50

5.5 Эксперименты

51

5.5.1 Реакционные компоненты для мультиплексного анализа

51

5.5.2 Протокол езды на велосипеде

51

5.6 Анализ данных генной экспрессии

52

Генотипирование / аллельная дискриминация

54

6.1 Экспериментальный дизайн

55

6.2 Разработка грунтовки и зонда с использованием зондов TaqMan

56

6.3 Экстракция ДНК и подготовка образца

57

6.4 Компоненты реакции при использовании зондов TaqMan

58

6.5 Оптимизация

59

6.6 Протокол езды на велосипеде с использованием TaqMan Probes

59

6.7 Анализ данных аллельной дискриминации

59

6.7.1 Проверка достоверности анализа аллельной дискриминации

59

6.7.2 Присвоение генотипа

72

Страница 4

Обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО)

76

7.1 Экспериментальный дизайн

77

7.2 Экстракция ДНК и подготовка образца для обнаружения ГМО

77

7.3. Обнаружение ГМ-сои с использованием однократного анализа SYBR Green I qPCR

78

7.3.1 Компоненты реакции

78

7.3.2 Протокол езды на велосипеде

79

7.3.3 Анализ данных

79

7.4 Обнаружение ГМ-сои с использованием мультиплексного анализа TaqMan qPCR

81

7.4.1 Компоненты реакции

82

7.4.2 Протокол езды на велосипеде

82

7.4.3 Анализ данных

82

Руководство по продукту

85

содержание

оглавление iii

Страница 5

Обзор

ПЦР в реальном времени

Ключевые понятия ПЦР в реальном времени

2

Что такое ПЦР в реальном времени?

2

Как работает ПЦР в реальном времени

3

Отличительные признаки оптимизированного анализа КПЦР

4

Страница 6

обзор ПЦР в реальном времени

ключевые концепции ПЦР в реальном времени

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

2

1. Обзор

ПЦР в реальном времени

Амплификация и обнаружение нуклеиновых кислот являются одними из наиболее ценных методов.

используется в биологических исследованиях сегодня. Ученые во всех областях исследований - основные

наука, биотехнология, медицина, криминалистика, диагностика и многое другое -

полагаться на эти методы для широкого спектра применений. Для некоторых приложений

качественного обнаружения нуклеиновых кислот достаточно. Другие приложения, однако, требуют

количественный анализ. Выбор лучшего метода для вашего приложения требует

широкие знания доступных технологий.

Это руководство представляет собой введение во многие технические аспекты реального времени.

ПЦР. Он содержит рекомендации по разработке лучшего анализа ПЦР в реальном времени для вашего

экспериментирует и объясняет, как данные ПЦР в реальном времени используются в различных приложениях.

В разделах 5–7 мы представляем примеры протоколов и данных, которые демонстрируют использование

ПЦР в реальном времени в конкретных приложениях, а именно: анализ экспрессии генов, аллель

дискриминация и обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО).

Мы надеемся, что это руководство предоставит вам информацию, необходимую для

мощная техника для вашей скамейки - и не только.

1.1 Ключевые понятия ПЦР в реальном времени