Проверка достоверности анализа аллельной дискриминации

Мы проанализировали ДНК от людей с WT и мутантными генотипами на FVL и

Мутации PT G20210A; шесть возможных результатов показаны на рисунках 6.2–6.7.

Человек WT (рисунок 6.2) показывает флуоресцентный сигнал для обоих датчиков WT, но

не для их мутантных аналогов (FVL и PT G20210A). Человек, который

является гомозиготным по одной из двух мутаций (рисунки 6.3 и 6.4), показывает

флуоресцентный сигнал с зондом, комплементарным мутантной последовательности, но не

со своим аналогом WT и другим флуоресцентным сигналом с другим зондом WT

но не со своим аналогом-мутантом. Лица, которые являются гетерозиготными для одного

цель генерирует флуоресцентный сигнал с обоими зондами для этой цели (рис. 6.5

и 6,6). Сложные гетерозиготные особи генерируют флуоресцентные сигналы со всеми

четыре зонда (два зонда WT и два мутантных зонда; см. рис. 6.7).

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

59

Страница 64

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

60

Рис. 6.2. WT генотип.

Зонд FVL WT / FAM

PT G20120A WT-зонд / TAMRA

Страница 65

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

61

Зонд для мутантов FVL / TET

PT G20210A мутантный зонд / техасский красный

Страница 66

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

62

Рис. 6.3. Гомозиготный мутант FVL.

Зонд FVL WT / FAM

PT G20120A WT-зонд / TAMRA

Страница 67

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

63

Зонд для мутантов FVL / TET

PT G20210A мутантный зонд / техасский красный

Страница 68

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

64

Рис. 6.4. Гомозиготный мутант PT G20210A.

Зонд FVL WT / FAM

PT G20120A WT-зонд / TAMRA

Страница 69

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

65

Зонд для мутантов FVL / TET

PT G20210A мутантный зонд / техасский красный

Страница 70

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

66

Рис. 6.5. Гетерозиготный генотип FVL G1691A.

Зонд FVL WT / FAM

PT G20120A WT-зонд / TAMRA

Страница 71

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

67

Зонд для мутантов FVL / TET

PT G20210A мутантный зонд / техасский красный

Страница 72

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

68

Рис. 6.6. Гетерозиготный генотип PT G20210A.

Зонд FVL WT / FAM

PT G20120A WT-зонд / TAMRA

Страница 73

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

69

Зонд для мутантов FVL / TET

PT G20210A мутантный зонд / техасский красный

Страница 74

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

70

Рис. 6.7. Соединение гетерозиготного генотипа FVL и PT G20210A.

Зонд FVL WT / FAM

PT G20120A WT-зонд / TAMRA

Страница 75

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

71

Зонд для мутантов FVL / TET

PT G20210A мутантный зонд / техасский красный

Страница 76

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

72

Чтобы изучить воспроизводимость четырехцветного анализа, шесть образцов ДНК из

особи с известными генотипами (WT, гомозиготный мутант FVL, PT G20210A

гомозиготный мутант, FVL гетерозиготный, PT G20210A, гетерозиготный, и FVL / PT

Соединение G20210A (гетерозиготное) и контроль без матрицы были протестированы в пяти

эксперименты. Во всех случаях анализы образцов давали

однозначные генотипы.

Присвоение генотипа

Генотипы могут быть назначены путем анализа графиков амплификации, сгенерированных для каждого

аллель-специфический зонд или с помощью доступного модуля анализа аллельной дискриминации

в программном обеспечении многих инструментов реального времени, включая iCycler iQ, DNA Engine

Системы Opticon ® 2, Chromo4 и iQ5 (см. Руководство по продукту). После

усиление ПЦР в реальном времени завершено, iCycler iQ, iQ5 и Opticon Monitor ™

программные пакеты могут назначать генотипы, используя алгоритм, который учитывает

учитывать сигнал от назначенных WT и гомозиготных мутантных контролей. Эти

программные пакеты могут анализировать либо конечные относительные флуоресцентные единицы (RFU), либо

Значения C T и график данных в виде точечной диаграммы.

Для многоцветного мультиплексного анализа, описанного здесь, генотипы для каждого гена были

назначается программным обеспечением iCycler iQ в режиме RFU и отображается на

отдельные участки. На рисунке 6.8 показаны генотипы для коагуляции.

ген фактора V, с четырьмя четко определенными кластерами, показанными на графике. Первый кластер

состоит из выборок со значениями сигнала FAM (ось x) в пределах 1050–1700 RFU и

представляет людей с генотипом WT. Второй кластер включает в себя образцы

со значениями сигнала TET (ось Y) в пределах 1000–1600 RFU и представляет отдельных лиц

Рис. 6.8. Генотипирование фактора свертывания крови V с помощью многоцветного мультиплексного анализа TaqMan.

Показаны нормированные значения флуоресценции FAM (зонд WT) в сравнении с TET (зонд мутанта FVL).

Страница 77

генотипирование / аллельная дискриминация

анализ данных аллельной дискриминации

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

73

Рис. 6.9. Генотипирование PT с помощью многоцветного мультиплексного анализа TaqMan. Нормализованная флуоресценция

показаны значения TAMRA (зонд WT) и техасского красного (зонд мутанта PT).

с гомозиготным мутантным генотипом FVL. Третий кластер (FVL гетерозиготный

физические лица) включает образцы со значениями сигналов FAM и TET в пределах 300–1100

РФС. Последний кластер представляет выборки с очень низкими значениями RFU для обоих FAM

и ТЕТ; это элементы управления без шаблонов. Аналогично, на рисунке 6.9 показан PT

генотипы в четырех четко определенных кластерах. Результаты генотипирования, полученные

мультиплексный четырехцветный анализ и анализ с помощью программного обеспечения были в согласии с

результаты анализа генотипирования RFLP (данные не показаны).

Страница 78

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

74

Страница 79

Генетически модифицированный

Организм (ГМО)

обнаружение

Экспериментальная дизайн

77

Экстракция ДНК и подготовка образца для обнаружения ГМО

77