ДНК-связывающие красители (SYBR Green I)

Наиболее часто используемым ДНК-связывающим красителем для ПЦР в реальном времени является SYBR Green I,

который неспецифично связывается с двухцепочечной ДНК (дцДНК). СИБР Зеленый Я

проявляет небольшую флуоресценцию, когда он свободен в растворе, но его флуоресценция увеличивается

до 1000 раз, когда он связывает дцДНК (рис. 2.1). Поэтому в целом

флуоресцентный сигнал от реакции пропорционален количеству присутствующей дцДНК,

и будет увеличиваться по мере усиления цели.

ПЦР

Unbound SYBR Зеленый I

Связанный SYBR Green I

Рис. 2.1. ДНК-связывающие красители в ПЦР в реальном времени. Флуоресценция резко возрастает, когда краситель

молекулы связываются с дцДНК.

Страница 15

начиная

соображения экспериментального дизайна

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

11

Рис. 2.2. Анализ кривой плавления продукта реакции из анализа SYBR Green I. Анализ кривой плавления

Функция инструментов реального времени может использоваться для различения конкретных продуктов от неспецифических продуктов.

А. Отрицательная первая производная изменения флуоресценции представлена ​​в виде функции температуры.

Два пика указывают значения T m двух продуктов ПЦР. Б. Гель-анализ продуктов КПЦР.

Дорожка 1, молекулярная линейка AmpliSize ® 50–2000 пар оснований (bp); дорожки 2 и 3, две копии КПЦР

продукт реакции, показанный в (А). Два продукта ПЦР выявляются отдельными полосами в геле.

A

В

Преимущества использования дсДНК-связывающих красителей включают простую конструкцию анализа

(требуется только два праймера; дизайн зонда не требуется), возможность тестирования нескольких

гены быстро без разработки нескольких зондов (например, для проверки гена

данные экспрессии от многих генов в эксперименте с микрочипами), более низкая начальная стоимость

(датчики стоят дороже), а также возможность выполнить анализ кривой плавления для проверки

Специфика реакции амплификации.

Анализ кривой плавления может быть использован для идентификации различных продуктов реакции, в том числе

Неспецифические продукты. После завершения реакции амплификации кривая расплава

генерируется путем увеличения температуры с небольшими приращениями и мониторинга

флуоресцентный сигнал на каждом шаге. Как дцДНК в реакции денатурирует (т. Е. Как

ДНК «плавится»), флуоресценция уменьшается. Первая отрицательная производная

изменение флуоресценции наносится на график как функция температуры. Характеристика

пик при температуре плавления ампликона (Т м, температура, при которой 50%

пары оснований дуплекса ДНК разделены) отличает его от других продуктов

такие как праймеры-димеры, которые плавятся при разных температурах. Примером этого

показано на рисунке 2.2. Пик расплава с Т м 89 ° С представляет собой удельный

продукта, и соответствует верхней полосе на дорожках 2 и 3 на геле. Пик

с Т м 78 ° С представляет собой неспецифический продукт и соответствует

нижняя полоса на дорожках 2 и 3 на геле.

Основным недостатком ДНК-связывающих красителей является их отсутствие специфичности, то есть

ДНК-связывающие красители связываются с любой дцДНК. В результате наличие неспецифического

продукты в реакции ПЦР в реальном времени могут способствовать общей флуоресценции и

влияет на точность количественного определения. Другим следствием является то, что ДНК-связывание

красители не могут быть использованы для мультиплексных реакций, потому что флуоресцентные сигналы от

разные ампликоны не различимы. Вместо этого вы можете настроить параллельное

реакции для изучения нескольких генов, таких как ген интереса и ссылки

ген, в ПЦР-анализе в реальном времени с SYBR Green I.

Страница 16

начиная

соображения экспериментального дизайна

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

12