Анализ данных генной экспрессии

52

Страница 50

анализ экспрессии генов

Экспериментальная дизайн

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

46

5. Экспрессия генов

Анализ

Наиболее распространенным применением ПЦР в реальном времени является изучение экспрессии генов.

Измерение экспрессии генов имеет фундаментальное значение во многих областях

современные биомедицинские исследования, от фундаментальной науки до практической

применения в промышленности и медицине. В большинстве исследований экспрессии генов

Исследователи заинтересованы в определении относительных уровней экспрессии генов в

Тест против контрольных образцов. Например, исследователь может быть заинтересован в

экспрессия определенного гена в раковых и нормальных тканях. В этой секции,

общие рекомендации и образец эксперимента по экспрессии генов представлены

продемонстрировать, как проводить анализ экспрессии генов с использованием ПЦР в реальном времени.

5.1 Экспериментальный дизайн

Образец анализа экспрессии генов с использованием мультиплексного анализа TaqMan представлен в

следующие разделы. В этом примере нас интересует относительное выражение

трех генов в пути биосинтеза полиаминов, орнитиндекарбоксилаза

(ODC), ODC-антизим (OAZ) и антизим-ингибитор (AZI) в двух разных образцах,

образец A и образец B. Из-за возможных ошибок пипетирования и первоначального количественного определения

ошибки ввода РНК, количество исходной кДНК в разное время

реакции могут быть разными. В этом примере экспрессия эталонного гена,

β-актин был выбран в качестве нормализатора для контроля любой разницы в вводе кДНК

количество. Следующие шаги были выполнены для определения относительного выражения

Уровень ODC, OAZ и AZI в двух разных образцах:

1. РНК была выделена из образца А и образца В.

2. РНК была обратно транскрибирована в кДНК.

3. Количество генов-мишеней (ODC, OAZ и AZI) и эталонный ген

(β-актин) определяли в каждом из образцов кДНК с использованием мультиплекса

анализ КПЦР.

4. Были проанализированы данные и относительная экспрессия каждого из генов-мишеней в

два образца были рассчитаны.

Страница 51

анализ экспрессии генов

рна изоляция

Этот рабочий процесс, типичный для экспериментов RT-КПЦР, обобщен в

Рисунок 5.1. В следующих разделах мы рассмотрим практические

выполнение каждого шага, указанного в рабочем процессе анализа экспрессии генов.

5.2 Изоляция РНК

Сбор образцов

Для количественной оценки экспрессии генов материал образца должен быть как можно более однородным.

насколько это возможно. Если ваш образец ткани состоит из множества различных типов клеток, точно

образец экспрессии вашего целевого гена может быть трудным. Если у тебя есть

гетерогенный образец, используйте один из многих методов, которые доступны для

выделение и выделение определенных типов клеток. Эти методы включают ткани

рассечение, биопсия иглы и микродиссекция лазерного захвата. Собранные

Затем клетки можно использовать для получения образцов РНК.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

47

Рис. 5.1. Рабочий процесс анализа генной экспрессии.

Выделение РНК

Обратная транскрипция (RT)

Разработка анализа КПЦР

КПЦР эксперимент

Анализ данных

Страница 52

анализ экспрессии генов

рна изоляция

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

48

Экстракция РНК

Для большинства применений RT-qPCR в реальном времени можно использовать либо общую, либо поли (A +) РНК.

Одно из важнейших соображений при работе с РНК - избегать РНКаз в ваших решениях,

расходные материалы и лабораторное оборудование. Готовые к использованию решения, не содержащие РНКазы, могут быть

купить. В качестве альтернативы обработайте растворы диэтилпирокарбонатом (DEPC) и

затем автоклавировать их. РНКазы на лабораторном оборудовании также могут быть деактивированы DEPC

обработка или выпекание при 250 ° С в течение 3 часов. Доступны расходные материалы без содержания РНКазы

для покупки из многих коммерческих источников.

Подготовленные образцы РНК могут нуждаться в обработке ДНКазой для предотвращения потенциальной

амплификация любой загрязняющей геномной ДНК, которая может привести к

завышение количества копий мРНК. Когда исходный материал

однако, лечение ДНКазой может быть нецелесообразным, так как

манипуляции могут привести к потере РНК. Усиление потенциала

загрязнение геномной ДНК может быть предотвращено путем разработки специфичного для транскрипта

праймеры, например, праймеры, которые охватывают или амплифицируются в местах сплайсинга.