Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь FAQ Написать работу КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Оптимизация мультиплексных анализовСодержание книги
Поиск на нашем сайте
30
соображения мультиплексирования конструкция праймера и зонда для мультиплексирования © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 28 3. Вопросы мультиплексирования Если вы решили провести свои эксперименты с КПЦР путем усиления более одна цель в одной реакционной трубе, то есть мультиплексирование (см. раздел 2.2.1), Прочитайте следующий раздел, прежде чем начинать эксперименты. Успешное мультиплексирование является результатом тщательного экспериментального проектирования и оптимизации условий реакции, а не просто объединяя все праймеры и шаблоны в та же трубка. Это потому, что усиление любой цели может влиять на усиление других целей в той же трубке. Распространенной проблемой для мультиплексной ПЦР в реальном времени является усиление целей, которые имеют существенно разные концентрации. Пример исходит из генной экспрессии исследования, в которых интересующий ген (GOI) сравнивают с эталонным геном. Если Референтный ген присутствует в большом избытке и имеет более высокую эффективность амплификации чем ГОИ, усиление ГОИ может быть вытеснено и, таким образом, скомпрометирован амплификацией контрольного гена, когда оба амплифицированы в та же трубка (мультиплексирована). Это приведет к недооценке суммы GOI присутствует в образце. Следующие шаги должны быть использованы для разработки мультиплексного анализа: • Разработка последовательности праймеров и зондов • Выберите репортеров и гасителей для зондов • Оптимизировать индивидуальные анализы • Проверить мультиплексный анализ • При необходимости оптимизируйте мультиплексный анализ. В следующих разделах мы подробно обсудим каждый из этих шагов. 3.1 Учебник для начинающих и исследования для мультиплексирования Если вы настраиваете мультиплексный анализ TaqMan, следуйте инструкциям в Разделе 2.4. разработать индивидуальные анализы TaqMan. Дизайн всех праймеров с примерно Т же м (55-60 ° С), и все зонды с приблизительно одной и той же Т м (~ 5-10 ° С выше, чем праймеры). Важно убедиться, что разные праймеры и наборы зондов не проявляют комплементарность друг другу, потому что все праймеры и зонды будут присутствовать в одной реакции. Мы рекомендуем использовать в коммерческих целях доступное программное обеспечение, такое как Beacon Designer, для упрощения разработки учебника и наборы зондов для мультиплексных реакций.
соображения мультиплексирования подбор репортеров и гасителей для мультиплексирования 3.2 Выбор репортеров и Гасители для мультиплексирования Мультиплексные реакции требуют использования нескольких репортеров, чтобы следить за каждым человеком реакция амплификации. Чтобы отличить каждую реакцию, выберите репортер флуорофоров с минимально перекрывающимися спектрами излучения. Выбранные флуорофоры также должны быть совместимы с фильтрами возбуждения и эмиссии вашего реального времени инструмент. См. Руководство к вашему инструменту для получения списка совместимых флуорофоров. Например, для реакции четырехквартирного дома на Chromo4 ™, Iq прибора Icycler ® и Iq ™ 5 инструменты, мы рекомендуем использовать FAM, HEX, Texas Red и Cy5. Для пятиплексного Для анализа в системе iQ5 мы рекомендуем использовать FAM, HEX, TAMRA, Texas Red, и Cy5. 3.3 Оптимизация индивидуальных анализов Перед мультиплексированием Первым шагом в сборке мультиплексного анализа является оптимизация отдельных реакций. Определите эффективность каждой отдельной реакции, построив стандарт Кривая с использованием серии шаблонных разведений, как описано в разделах 1.1.3 и 2.3.2. Эффективность отдельных реакций должна составлять 90–105%. 3.4 Валидация мультиплексных анализов Проведите одноплексный и мультиплексный анализы для ваших целей на одной тарелке и сравнить значения C T. Значения, полученные для данной цели в одиночном и мультиплексные анализы не должны существенно отличаться. Если значения C T из Singleplex и мультиплексная реакция значительно различаются, вам нужно будет оптимизировать ваши реакции. Это может быть достигнуто путем изменения концентрации компоненты реакции, как описано в разделе 3.5. iQ ™ multiplex powermix значительно упрощает оптимизацию мультиплексных анализов, обычно обеспечение одинаковой эффективности в одно- и мультиплексных анализах. © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 29
соображения мультиплексирования оптимизация мультиплексных анализов © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 30 3.5 Оптимизация мультиплексных анализов Если мультиплекс реакция не оптимизирована, усиление менее - эффективность или меньше - обильная цель может быть ингибирована более - эффективными или более - обильными целями. Это потому, что компоненты реакции, такие как ДНК-полимераза и нуклеотиды, становятся ограничивающими в более поздних циклах и усиление менее - эффективно или менее - Обильная цель скомпрометирована. Этот ингибирующий эффект очевиден при сравнении графика усиления фиксированного количество ампликона в однократной реакции на тот же ампликон в мультиплексная реакция: C T для мультиплексной реакции задерживается по сравнению с C T для одноплексной реакции. Это показано на рисунке 3.1, где усиление из четырех мишеней, β-актин, орнитиндекарбоксилаза (ODC), ODC антизим (OAZ) и антизим-ингибитор (AZI), проводился в однократных реакциях (синяя линия) и в мультиплексной реакции с другими идентичными компонентами реакции (голубая линия). Усиление два менее - обильных целей, ODC и азимут, был затронут, и привело к задержанным значениям C T в мультиплексных реакциях по сравнению с соответствующие одиночные реакции. Рис. 3.1. Оптимизация концентрации ДНК-полимеразы iTaq ™ в четырехплексных реакциях. MgCl 2 и dNTP концентрации были постоянными, в то время как концентрация iTaq в одноплексном режиме (1x) сравнивалась с мультиплексной условия с использованием увеличения количества iTaq ДНК-полимеразы (1–4x). Гены β-actin и OAZ (те, с самой высокой экспрессией в этом примере) были амплифицированы с одинаковой эффективностью в одиночном и мультиплексном условия при всех протестированных концентрациях iTaq. Гены с более низкой экспрессией, AZI и ODC, требуются дополнительная полимераза iTaq для достижения мультиплексной эффективности амплификации, сравнимой с однократное усиление. 10000 1000 100 10 1 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 10000 1000 100 10 1 10000 1000 100 10 1 цикл 1000 100 10 1 цикл β- актин OAZ AZI ODC п С р б a s е лин е s U б тра с тэ d р F U - Singleplex, 1.25 U iTaq - Fourplex, 1.25 U iTaq - Fourplex, 2,5 U iTaq - Fourplex, 3,75 U iTaq - Fourplex, 5 U iTaq
Одним из способов оптимизации мультиплексных реакций является увеличение концентрации ДНК-полимераза, дНТФ и MgCl 2. Для оптимизации амплификации β-актина, ODC, AZI и OAZ в мультиплексной реакции, мы последовательно увеличивали концентрации ДНК-полимеразы, MgCl 2 и дНТФ. Во-первых, мы увеличили концентрацию ДНК-полимеразы iTaq в мультиплексе. реакция с шагом 1,25 единицы (U), от 1,25 U на реакцию до 5 U на реакцию. При увеличении концентрации ДНК-полимеразы мы наблюдали увеличение эффективность амплификации для ODC и AZI, как показано на рисунке 3.1. На основании этих Данные, мы решили использовать 3,75 U ДНК-полимеразы на последующих этапах оптимизации. Затем мы проверили эффект увеличения MgCl 2 с 3,5 мМ до 5 мМ и dNTPs от 200 мкМ до 400 мкМ. Как показано на рисунке 3.2, когда ДНК-полимераза iTaq концентрация была установлена на уровне 3,75 Ед на 50 мкл реакции, наш мультиплексный анализ с четырьмя генами получено 5 мМ MgCl 2 без увеличения, необходимого для dNTP. соображения мультиплексирования оптимизация мультиплексных анализов © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 31 Рис. 3.2. Оптимизация концентраций MgCl 2 и dNTP в четырехплоскостных реакциях. Сохраняя Константа концентрации iTaq ДНК-полимеразы при 3,75 U на 50 мкл реакции, влияние MgCl 2 и dNTPs концентрации были оценены. Комбинация 5,0 мМ MgCl 2, 200 мкМ dNTPs и 3,75 U iTaq ДНК Полимераза дала лучшее усиление в мультиплексных реакциях (здесь не показаны одноплексные реакции). п С р б a s е лин е s U б тра с тэ d р F U 10000 1000 100 10 1 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 β- актин 10000 1000 100 10 1 ODC 1000 100 10 1 AZI 1000 100 10 1 OAZ цикл цикл MgCl 2 дНТФ - 3,5 мМ 200 мкМ - 3,5 мМ 400 мкМ - 5,0 мМ 200 мкМ - 5,0 мМ 400 мкМ
соображения мультиплексирования optimization of multiplex assays © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 32 Рис. 3.3. Проверка эффективности мультиплексного анализа. Данные из однократного (синий) и четырехплексного (красный) Реакции (четыре повторения, каждый с использованием кДНК простаты человека в качестве матрицы) накладываются. Сюжеты полностью перекрываются во время экспоненциальной фазы. В таблице приведены средние значения C T для одиночного сплетения и мультиплексные реакции. п С р б a s е лин е s U б тра с тэ d р F U 10000 1000 100 10 1 β- актин 10000 1000 100 10 1 OAZ 10000 1000 100 10 1 ODC 1000 100 10 1 AZI цикл цикл C T Значения β- актин ODC AZI OAZ Singleplex 17,0 ± 0,0 23,0 ± 0,2 22,2 ± 0,1 20,8 ± 0,1 мультиплекс 17,3 ± 0,0 23,1 ± 0,2 22,2 ± 0,1 20,8 ± 0,2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Чтобы проверить эффективность оптимизированного мультиплексного анализа, мы выполнили боковые сравнения одно- и мультиплексных реакций для каждого набора праймер-зонд при оптимизированные условия (3,75 U iTaq, 5 мМ MgCl 2, 200 мкМ dNTPs). В режиме реального времени участки амплификации, генерируемые в одноплексных и мультиплексных условиях, должны показывать одинаковые значения C T и быть наложенными во время экспоненциальной фазы усиления. Успешные мультиплексные условия действительно были достигнуты, когда используя образцы общей РНК из простаты человека (рис. 3.3) и тонкой кишки (данные не показаны) в качестве шаблона.
КПЦР в реальном времени Анализ данных
|
||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2021-04-12; просмотров: 101; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.117.192.205 (0.009 с.) |