Разработка и оптимизация реакций SYBR Green I

19

Праймер и Ампликон Дизайн

19

Проверка правильности и оптимизация

20

Оптимизация температуры отжига

20

Оценка эффективности анализа с использованием стандартных кривых

22

Разработка и оптимизация реакций на зонд TaqMan

23

Учебник для начинающих и исследования

23

Проверка правильности и оптимизация

24

Страница 12

начиная

Общие Соображения

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

8

2. Начало работы

Теперь, когда мы ввели понятия, лежащие в основе КПЦР в реальном времени, мы можем углубиться

в более практические вопросы. В этой главе мы предлагаем рекомендации по настройке

ваши анализы КПЦР в реальном времени, включая основные лабораторные методы (раздел 2.1),

основные экспериментальные конструкции и компоненты реакции (раздел 2.2), решающие

между одноплексным и мультиплексным анализами (раздел 2.2.1) и выбором в реальном времени

химия (раздел 2.2.2). Мы также предоставляем более подробные инструкции по настройке

Реакции КПЦР с использованием двух самых популярных химикатов, SYBR Green I

(Раздел 2.3) и TaqMan (раздел 2.4).

2.1 Общие соображения

Правильная лабораторная техника - важный, но часто пропускаемый шаг к

успешная ПЦР в реальном времени. Для достижения оптимальных результатов вы должны минимизировать потенциал

перекрестное загрязнение между образцами и предотвращение переноса нуклеиновых кислот из

один эксперимент к другому. Следующие меры предосторожности помогут вам избежать

проблемы загрязнения:

• Протирать рабочие станции разбавленными растворами отбеливателя или коммерчески

доступные решения по дезактивации

• Подготовьте образцы в специально отведенной для этого чистой комнате, вытяжке или на рабочем месте.

оснащен ультрафиолетовой лампой. В идеале это должно быть расположено в другой области

от термоциклера. Будьте осторожны, чтобы не загрязнить область плазмидами

или ампликоны; никогда не приносите продукты после усиления в назначенный

чистая зона

• Меняйте перчатки часто во время подготовки образца и настройки реакции

• Используйте защитные трубки и наконечники для аэрозольных барьеров.

• Часто чистите пипетки разбавленным раствором отбеливателя.

• Используйте только воду и реагенты для ПЦР, предназначенные только для ПЦР.

• Используйте пробирки с завинчивающейся крышкой для разбавления и настройки реакции.

Помимо принятия вышеуказанных мер предосторожности, вы всегда должны подготовить

контроль без шаблонов для ваших анализов ПЦР, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения

произошло. Кроме того, используйте полимеразу горячего старта, чтобы предотвратить неизбирательное

усиление до начала реакции.

Страница 13

начиная

соображения экспериментального дизайна

Чтобы свести к минимуму статистические различия в экспериментальных результатах, подготовьте мастер-миксы для

повторять реакции всякий раз, когда это возможно. Мы рекомендуем запустить все образцы в

тройные. Минимизируйте повторное замораживание и оттаивание, готовя небольшие аликвоты

запас реагента перед первым использованием.

2.2 Экспериментальные соображения дизайна

для КПЦР

Первым шагом в разработке эксперимента ПЦР в реальном времени является выбор наилучшего типа

анализа для эксперимента, представляющего интерес. Должен ли одноплексный или мультиплексный анализ

используемый? Какой тип химии в реальном времени следует использовать? В следующих

разделы, мы описываем каждый тип анализа и даем рекомендации о том, как выбрать

лучший тип анализа для вашего эксперимента.

Singleplex или Multiplex?

Как практические, так и научные причины могут заставить вас попробовать мультиплексирование,

усиление более чем одной мишени в одной реакционной пробирке. В настоящее время это

возможно усиление и количественное определение до пяти целей в одной пробирке, в зависимости от

на функции вашего инструмента ПЦР в реальном времени. Мультиплексирование дает следующее

Преимущества перед одноплексными реакциями:

• Сокращение количества необходимого стартового шаблона, что важно при

количество исходного материала ограничено

• Уменьшение количества ложных негативов, если контрольная цель усиливается в каждом образце

• Увеличение производительности лаборатории с сопутствующим снижением затрат на реагенты

• Минимизация обработки проб и связанные с этим возможности для лаборатории

загрязнение

Если ни одно из этих соображений не имеет значения для ваших анализов, то используйте однократный

реакции достаточно. Практические советы о том, как настроить и оптимизировать мультиплекс

Реакции КПЦР приведены в разделе 3.

Выбор химии

Ключевым шагом в разработке анализа КПЦР является выбор химического состава для мониторинга

амплификация последовательности-мишени. Разнообразие флуоресцентных химикатов доступно

можно разделить на два основных типа: 1) ДНК-связывающие красители (SYBR Green I),

и 2) меченые красителем, специфичные для последовательности олигонуклеотидные праймеры или зонды (молекулярные

Beacons и TaqMan, гибридизация и Eclipse-зонды, и Amplifluor, Scorpions,

Праймеры LUX и BD QZyme). Наиболее часто используемые химические препараты для ПЦР в реальном времени

ДНК-связывающие красители SYBR Green I и TaqMan для гидролиза. Мы предоставляем

обзор этих различных типов флуоресцентных химикатов в разделах 2.2.2.1–2.2.2.2.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

9

Страница 14

начиная

соображения экспериментального дизайна

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

10

Химический состав, выбранный вами для анализа КПЦР, зависит от вашего применения,

выполняете ли вы одноплексные или мультиплексные реакции, и соображения стоимости.

Как правило, для одноплексных экспериментов с низкой пропускной способностью ДНК-связывающие красители могут быть

предпочтительнее, потому что эти анализы легче спроектировать, быстрее настроить и

изначально более экономически эффективны. Для экспериментов с высокой пропускной способностью, однако,

Анализ на основе флуоресцентного праймера или зонда (одноплексный или мультиплексный) может быть более

желательно, потому что первоначальная стоимость может быть распространена на многие эксперименты и

Возможность мультиплексирования может сократить время анализа. Мультиплексные анализы требуют использования

химия на основе флуоресцентных праймеров или зондов, потому что отсутствие специфичности

ДНК-связывающие красители делают их несовместимыми с количественными мультиплексными анализами.