Обонятельные рецепторные белки и обонятельная трансдукция

Вплоть до сравнительно недавнего времени считалось, что количество "первичных" запахов невелико. Лишь с помощью современных молекулярно-генетических методов удалось относительно разобраться в этом вопросе.

 

Гены обонятельных рецепторных белков. В 1991 г. благодаря работе Р.Акселя и Л.Бак, удостоенных Нобелевской премии в 2004 г., выяснилось, что имеется около тысячи разных обонятельных рецепторных молекул, каждая из которых кодируется собственным геном. Позднее в результате расшифровки генома человека было точно показано, что у человека имеется около 900 таких генов. Впрочем, надо сказать, что функциональны из них лишь примерно 350, а 550 являются псевдогенами, утратившими возможность экспрессироваться в белки и пребывающими в геноме в качестве бесполезного балласта. У мыши тоже около 900 таких генов, но практически все они функциональны. Таким образом, гены обонятельных белков занимают несколько процентов генома (до 2-3% у млекопитающих) – это самое большое семейство генов в геноме. У рыб таких генов значительно меньше – например, у сома их не более сотни.

Каждому обонятельному рецепторному белку соответствует довольно широкий спектр веществ, на которые он реагирует, и, наоборот, каждое вещество способно восприниматься довольно большим количеством разных рецепторных белков. Комбинаторика из такого большого набора рецепторных белков позволяет воспринимать и различать огромное количество запахов – для человека их число оценивается в 10 тыс. Совокупность рецепторов, активированных и неактивированных данным веществом, образует так называемую "карту запахов". Обратите также внимание на то, что естественные запахи обычно обусловлены отнюдь не одним химическим веществом, а смесью из нескольких веществ в определенных соотношениях, составляющих целостный "запаховый объект". Например, неповторимый запах цветов жасмина определяется наличием в нем более двадцати различных летучих веществ.

Заметим сразу, что в вомероназальном органе представлены еще две группы рецепторных белков, каждый из которых кодируется своим собственным геном, т.е. в общей сложности это еще около 200 генов в составе генома млекопитающих.

 

Аносмии. Как и любые другие гены, гены обонятельных рецепторных белков могут подвергаться мутациям, делающим соответствующие белки нефункциональными. Видимо, с этим связаны случаи частичной аносмии – неспособности воспринимать запах и некоторой родственной группы веществ. Аносмия встречаются у людей не так редко. Например, каждый десятый человек не воспринимает запах миндаля, а один на тысячу не ощущает запаха секрета, выстреливаемого скунсом. Аносмии по сути аналогичны нарушениям цветового зрения, возникающим при нефункциональности одного из зрительных пигментов колбочек. В обще сложности известно несколько десятков аносмий, хотя их генетика изучена намного хуже, чем генетика аномалий цветового зрения. Многие виды аносмий наследуются по законам Менделя. Поскольку рецепторных белков очень много и спектры их реакций сильно перекрываются, то не исключено, что во многих случаях выпадение одного из них просто остается незамеченным – ведь, в конце концов, обходимся же мы и так лишь примерно третей частью от числа имеющихся у нас генов, потенциально кодирующих рецепторные белки. Ухудшение восприятия запахов называют гипосмией.

 

Сайты распознавания одорантов на рецепторных белках. Согласно современным представлениям, распознавание молекул одорантов действительно происходит на основе химических детерминант, таких как длина углеводородной цепочки, наличие в ней двойных связей, принадлежность веществ к спиртам, кетонам, кислотам, эфирам или аминам, наличие в структуре молекулы ароматических групп и др. (рис. [1516] ____).

Обонятельные рецепторные белки представляют собой уже знакомые нам семидоменные белки, состоящие в родстве со многими синаптическими рецепторами нервной системы, в том числе с β-адренергическим рецептором. В пространстве между семью доменами имеется специальный карман, уже знакомый нам как место расположения опсина в зрительных пигментах. Аминокислотные остатки белка, окружающие этот распознающий сайт, создают в нем определенную геометрию свободного пространства и определенное расположение зарядов вокруг него, в результате чего каждый из обонятельных рецепторных белков реагирует лишь на молекулы, обладающие конкретными стереохимическими особенностями. Каждая такая молекула должна подойти как ключ к замку – лишь в этом случае она будет воспринята. Для некоторых типов обонятельных рецепторов уже построены трехмерные компьютерные модели, воспроизводящие взаимодействие между рецептором и лигандом.

 В отличие от других рецепторов аналогичного типа, обонятельные рецепторные белки обладают не очень высокой избирательностью – они способны реагировать на целую группу сходных молекул. Видимо, это не является несовершенством, а, наоборот, позволяет определить запах практически любого летучего вещества независимо от его стереохимии, так как наверняка для него найдется хотя бы несколько разных (!) рецепторов, которые среагируют на него. К тому же одна молекула одоранта может нести на себе одновременно несколько стереохимических детерминант, подходящих к разным рецепторам. Мозаика активированных и неактивированных рецепторов собственно и будет характеризовать каждый запах. Разумеется, такая система будет работать лишь в том случае, если каждая ОРК экспрессирует лишь один рецепторный белок, а при конвергенции аксонов ОРК эта информация не теряется. Напомним, что горький вкус тоже воспринимается очень большим количеством рецепторных белков, сходных с обонятельными, однако мы практически не способны отличить один горький вкус от другого из-за того, что эта информация не доходит в ЦНС раздельным образом от каждого рецептора. Заметим, что избирательность рецепторных белков вомероназального органа намного выше, чем рецепторов основного обонятельного эпителия, так как он в значительной степени предназначен для распознавания совершенно конкретных видоспецифических феромонов.

 

Зоны экспрессии. В обонятельном эпителии млекопитающих можно выделить приблизительно четыре продольные зоны (три больших плюс еще одну меньшего размера), называемые зонами экспрессии, которые вытянуты в рострокаудальном направлении. ОРК, экспрессирующие каждый определенный ген рецепторного белка, располагаются в пределах одной зоны экспрессии. Раньше считалось, что в пределах каждой зоны ОРК разных типов перемешаны весьма хаотически. Сейчас имеются данные, что для некоторых запахов чувствительные к ним клетки образуют кластеры; иногда они группируются в основном, в передней, или, наоборот, в задней части эпителия (рис. Bear 8-17). Тем не менее, в пределах каждого конкретного участка эпителия перемешаны ОРК многих типов.

 

Обонятельная трансдукция. Обонятельные рецепторные белки связаны с G-белковой системой. В основном обонятельном эпителии чаще всего через G-белок происходит активация аденилатциклазы, которая синтезирует цАМФ (рис. [1517] ____). В некоторых случаях, правда, может происходить активация фосфолипазы с высвобождением ИТФ и ДАГ. Второй путь в основном представлен в вомероназальном органе, хотя встречается и в основном обонятельном эпителии. Показано, что каждый отдельный запах связан с синтезом либо цАМФ, либо ИТФ, но не обоих вторичных посредников одновременно. В случае синтеза цАМФ дальнейшие события происходят при участии катионных ЦНЗ-каналов, которые открываются в ответ на повышение концентрации цАМФ. Эти каналы не обладают высокой селективностью – они проницаемы для ионов Na⁺, K⁺ и Ca²⁺, которые движутся по электрохимическому градиенту и вызывают деполяризацию клетки, т.е. создают рецепторный потенциал. Своеобразная особенность ОРК состоит в том, что при повышении внутриклеточной концентрации ионов Ca²⁺ в их мембране открываются хлорные каналы; из-за того, что концентрация хлора в цитоплазме реснички выше, чем в окружающей ее слизи, поток ионов Cl^- по концентрационному градиенту усиливает деполяризацию клетки.

Величина деполяризации прямо зависит от концентрации одоранта – чем больше вещества, тем сильнее деполяризация. По последовательности аминокислот данные ЦНЗ-каналы чрезвычайно близки к ЦНЗ-каналам фоторецепторов. Более того, ЦНЗ-каналы ОРК in vitro реагируют не только на цАМФ, но и на цГМФ – физиологическое значение этого факта еще не ясно. Напомним, что ЦНЗ-зависимые каналы в фоторецепторах открываются как раз под воздействием цГМФ. Хотя у позвоночных реакция ОРК на запах обычно бывает деполяризационной по описанному выше механизму, у некоторых групп животных возможна и гиперполяризационная реакция.

В отличие от фоторецепторов, ОРК генерируют потенциалы действия, которые возникают при достижении соответствующего значения деполяризации и без декремента направляются по аксону в обонятельную луковицу. Спонтанная активность ОРК очень низка; каждая клетка реагирует возбуждением на некоторый спектр различных веществ, и для разных клеток этот спектр будет разным. Примеры реакций ОРК приведены на рисунках (рис. [1518] ____). Обратите внимание на то, как происходит кодирование запахового стимула в разряде одной клетки. Во-первых, частота разряда ОРК в ответ на стимул возрастает с повышением концентрации вещества. Во-вторых, каждая отдельная клетка способна кодировать лишь небольшой диапазон концентраций данного вещества, в пределах всего одного порядка: ниже этого диапазона клетка не активна, выше – наступает насыщение. Разные клетки обладают разным порогом, и соответственно, вовлекаются начиная с какой-то определенной концентрации вещества. Таким образом, весь диапазон интенсивностей кодируется не только частотой разряда отдельных клеток, но и количеством активированных клеток. Это означает, что слабый стимул активирует только низкопороговые нейроны, на более сильный стимул отвечают те же самые клетки в режиме насыщения плюс другие клетки с более высоким порогом и т.д. С аналогичной ситуацией мы уже сталкивались, когда рассматривали кодирование интенсивности звука в волокнах слухового нерва.

Поток входящих ионов Ca²⁺ запускает процесс адаптации, которая протекает в несколько последовательных этапов, каждый из которых развивается на своей временной шкале с разной скоростью. Адаптация в ОРК достаточно сложна и еще не до конца изучена.

Совокупная активация большого количества элементов обонятельной системы ведет к генерации электроольфактограммы амплитудой в несколько милливольт, которую можно зарегистрировать с помощью макроэлектродов, помещенных на обонятельный эпителий.

 

Обонятельная луковица

Как мы уже видели выше, аксоны ОРК проходят сквозь отверстия решетчатой кости и заканчиваются в обонятельной луковице, которая прилежит к этой кости с противоположной стороны – т.е. на внутренней поверхности черепа.

 

Строение и физиология обонятельной луковицы. Обонятельная луковица имеет отчетливую слоистую структуру, а которой можно выделить пять основных слоев. Аксоны ОРК заканчиваются в специальных образованиях, гломерулах (или обонятельных клубочках), которые образуют самый наружный слой обонятельной луковицы. Далее идут наружный плексиформный (синаптический) слой, слой митральных клеток, внутренний плексиформный слой и слой клеток-зерен (гранулярных клеток). Клетки-зерна заполняют центральную часть луковицы.

Митральные клетки – наиболее заметные элементы клеточной структуры обонятельной луковицы; по своей форме они некогда напомнили морфологам папскую митру, за что и получили свое название. Кроме того, в обонятельной луковице находятся также пучковые (пучковатые), перигломерулярные и клетки-зерна (или гранулярные клетки). Митральные и пучковые клетки возбудительные (медиатор глутамат), и их аксоны покидают обонятельную луковицу и направляются в головной мозг. Перигломерулярные клетки и клетки-зерна представляют собой локальные интернейроны. Медиатором перигломерулярных клеток является ГАМК и дофамин, а медиатором клеток-зерен – ГАМК. Внутренняя организация связей в обонятельной луковице очень сложна, и в ней обнаружено множество разных медиаторов – не менее двенадцати. Таким образом, она во многих отношениях сходна с сетчаткой. Мы рассмотрим ее здесь лишь в самых общих чертах.

Аксоны ОРК образуют синаптические контакты с дендритами митральных, пучковых и перигломерулярных клеток. Первичные дендриты приблизительно 25 митральных клеток вместе с синаптическим окончаниями от ОРК образуют сферическую структуру, называемую гломерулой, или обонятельным клубочком. Размер гломерулы варьирует от 50-100 мкм у мыши до 150-200 мкм у кролика – т.е. по размеру она примерно соответствует бочонку в соматосенсорной коре или ориентационной колонке в зрительной коре.

Конвергенция в гломерулах очень велика – например, у кролика на каждую митральную клетку приходят аксоны примерно тысячи ОРК. Следовательно, в одной гломеруле кролика собираются волокна примерно от 25 тыс. рецепторных клеток. Всего в обонятельной луковице имеется порядка одной – двух тысяч гломерул. Например, у крысы 15 млн. рецепторов конвергируют примерно в 1500 гломерул.

Несмотря на очень большую степень конвергенции, потери информации практически не происходит, так как в каждую гломерулу собираются аксоны от ОРК одного и того же типа, экспрессирующих один и тот же обонятельный рецепторный белок (рис. [1519] ____). Если смотреть по всей площади обонятельного эпителия, то окажется, что ОРК каждого конкретного типа посылают свои аксоны в очень небольшое количество гломерул или даже только в одну.

Возникает вопрос, как ОРК каждого типа, достаточно хаотически разбросанные по поверхности обонятельного эпителия в пределах зоны экспрессии и перемешанные с ОРК многих других типов, находят свои клубочки – и это при том, что ОРК многократно обновляются в течение жизни животного. По всей видимости, в этом процессе участвуют некие локальные химические маркеры, которые направляют рост аксонов ОРК, однако этот вопрос пока еще остается малоисследованным. Не исключено также, что ветви аксонов исходно прорастают в большее число гломерул, чем нужно, однако в дальнейшем сохраняются лишь те ветви, активность в которых совпадает по времени с активностью соответствующей гломерулы, а остальные отмирают.

Интересно, что расположение гломерул в обонятельной луковице одинаково у всех представителей одного вида. Таким образом, карта запахов – т.е. мозаика активированных типов ОРК – преобразуется во вполне определенную пространственную карту распределения активности по площади обонятельной луковицы. Эту карту можно непосредственно наблюдать в эксперименте с помощью дезоксиглюкозного метода, оптической регистрации и других способов, позволяющих видеть активность совокупности нейронов по большой площади нервной ткани. С помощью таких методов было показано, что действительно, каждое конкретное вещество активирует вполне определенный набор участков обонятельной луковицы. Чем больше концентрация вещества, тем больше гломерул активируется в ответ на него (видимо, это связано с тем, что разные типы рецепторных белков реагируют на одно и то же вещество с разным порогом).

 

Характер обработки обонятельного сигнала в обонятельных луковицах. Синапсы, образуемые аксонами ОРК на митральных, пучковых и перигломерулярных клетках – глутаматергические, возбуждающие, т.е. сохраняющие знак. Митральные и пучковые клетки – также глутаматергические; помимо проекций в ЦНС они образуют возбуждающие связи на тормозных клеточных интернейронах обонятельной луковицы. Таким образом, прямой путь через обонятельную луковицу проходит только через возбудительные синапсы (т.е. происходит с сохранением знака, а именно передает возбуждение в ответ на запах).

В обонятельной луковице, как и в сетчатке, есть два уровня горизонтальных взаимодействий, которые носят преимущественно тормозный характер и сильно видоизменяют характер выходного сигнала (рис. [1520] ____).

На уровне синапсов от аксонов ОРК к митральным и пучковым клеткам вмешиваются перигломерулярные клетки. Все входы на перигломерулярные клетки - возбудительные глутаматергические (от ОРК, митральных и пучковых клеток), а выходы с них – тормозные, ГАМК-ергические. Синапсы перигломерулярных клеток с митральными и пучковыми клетками – дендродендритные и, как правило, с двунаправленной реципрокной передачей сигнала.

Перигломерулярные клетки ветвятся в пределах одной гломерулы, но при этом они также посылают длинные отростки в соседние гломерулы. Таким образом они реализуют как возвратное торможение в пределах своей гломерулы, так и латеральное торможение между соседними гломерулами. Таким образом, по характеру связей и своим функциям перигломерулярные клетки оказываются аналогами горизонтальных клеток сетчатки. Как и горизонтальные клетки сетчатки, перигломерулярные клетки не имеют аксонов и производят градуальную передачу сигнала. Часть перигломерулярных клеток выделяет дофамин.

Клетки зерна также образуют реципрокные дендро-дендритные синапсы со вторичными дендритами митральных клеток, синаптический выход с них опосредуется ГАМК. Организация связей клеток-зерен также позволяет им производить как возвратное, так и латеральное торможение.

Поскольку в обонятельной луковице присутствуют сложная система тормозных связей, характер импульсного ответа ее выходных элементов сильно отличается от реакции ОРК. Типичный ответ митральной клетки состоит из пачки импульсов, вслед за которой наступает длительное торможение (рис. [1521] ____). Нередко пачке импульсов предшествует еще одна короткая фаза торможения. Часть клеток дает ответ, состоящий из одного лишь торможения.

Хотя довольно трудно говорить об оппонентных рецептивных полях митральных клеток в том же смысле, как и для ганглиозных клеток сетчатки, однако оппонентность в ответах нейронов обонятельной луковицы отчетливо присутствует. Она проявляется в том, что митральные клетки, находящиеся на достаточном расстоянии друг от друга (более 150 мкм, т.е. не менее диаметра гломерулы), дают ответы, противоположные друг другу по знаку: если одна клетка возбуждается на определенное вещество, то другая на него тормозится, и наоборот. По-видимому, смысл латерального торможения в обонятельной луковице тот же, что и в других сенсорных системах – повышение контраста. Поскольку вторичные дендриты митральных клеток достаточно длинные и тянутся через несколько соседних гломерул, латеральное торможение может распространяться достаточно широко. Наоборот, митральные летки, расположенные близко друг к другу (порядка 40 мкм) и, вероятно, относящиеся к одной гломеруле, обычно реагируют на запахи одинаковым образом.

 

Модуляция обработки сигнала в обонятельных луковицах. В электрофизиологических экспериментах показано, что ответы митральных клеток зависят от состояния животного. Например, митральные клетки голодной крысы интенсивно отвечают на запах пищи, однако ответ подавляется после того, как животное насытится.

Внутренняя регуляция передачи сигнала в обонятельной луковице может происходить через выделения дофамина из перигломерулярных клеток; митральные клетки несут на своих дендритах D2 рецепторы. Кроме того, обонятельная луковица получает нисходящую афферентацию, которая способна сильно модулировать активность ее клеток в ответ на запахи. Это норадренергические проекции из голубого пятна, серотонинергические проекции из дорсального ядра шва и холинергические проекции из базальных ядер конечного мозга. В частности, показано, что норадреналин ослабляет торможение, оказываемое клетками-зернами на митральные клетки.

 

Вомероназальный орган

Вомероназальный орган представляет собой слепой канал под носовой полостью. У рыб он полностью отсутствует, а впервые появляется у змей, которые пользуются им для поиска добычи: они высовывают свой раздвоенный язык, а затем засовывают его через ноздри в свой вомероназальный орган. У большинства млекопитающих он хорошо развит. По некоторым данным, вомероназальный орган обнаруживается у 8% взрослых людей, хотя, по всей видимости, он присутствует у них в качестве нефункционального рудимента.

В основном, вомероназальный орган предназначен для восприятия феромонов и родственных им веществ. Многие животные при обнюхивании особи противоположного пола совершают характерные движения носом с целью направить поток воздуха к вомероназальному органу. У копытных самец изучает мочу самок непосредственно, что позволяет ему определить ее готовность к спариванию.

Достаточно детально изучены феромоны мыши – их оказалось довольно много, большинство из них содержится в моче самцов или самок, а также в секрете железы крайней плоти самцов. Эти феромоны способны оказывать очень сильное воздействие на организм мыши. Например, феромоны, содержащиеся в моче самцов и секрете желез их крайней плоти, ускоряют половое созревание самок, а феромоны из мочи самок – наоборот, тормозят его. Ряд феромонов, выделяемых самцами, влияет на время наступления и длительность эструса у самок. Феромоны также запускают массу поведенческих реакций, влияя непосредственно на мотивационный статус животного.

По своей гистологической структуре эпителий вомероназального органа мало отличается от основного обонятельного эпителия. На ОРК присутствуют обонятельные рецепторные белки двух семейств, которые не имеют близкого сходства по своей аминокислотной последовательности с ОРК основного обонятельного эпителия. В каждом семействе имеется около 100 белков, каждый из которых кодируется своим геном. Белки одного из этих семейств по наличию длинного внеклеточного N-концевого домена сходны с рецептором mGluR и с рецептором сладкого TR1. Обонятельные рецепторные белки вомероназального органа имеют значительно более высокую специфичность по отношению к своим лигандам, чем аналогичные белки основной обонятельной системы. Клетки вомероназального органа чрезвычайно чувствительны и активируются при концентрациях до 10^-11 М. В процессе трансдукции в ОРК вомероназального органа образуется ИТФ.

Волокна из вомероназального эпителия направляются в дополнительную обонятельную луковицу, которая обычно располагается кзади от основной. В ней также присутствуют гломерулы, хотя они выражены слабее.

Не следует думать, что основной обонятельный эпителий не способен реагировать на феромоны. Так, оказалось, что наиболее хорошо изученный феромон млекопитающих – а именно андростенедион свиньи – воспринимается как раз основным обонятельным эпителием, а не вомероназальным органом. Хотя у человека вомероназальный орган не выражен, томографические исследования на людях показали, что при вдыхании эстрогенов и андрогенов возникает отчетливая активация гипоталамуса (причем картина активации различается для мужчин и женщин). Впрочем, никаких феромонов в истинном смысле этого слова у человека пока не обнаружено.