Определение концентрации общего билирубина в сыворотке крови

 

 

Принцип метода: В кислой среде в присутствии диазотированного 2,4-дихлоранилина билирубин образует азосоединение красного цвета. Специфическая смесь детергентов делает возможным надежное и точное определение общего билирубина.

Интенсивность окраски раствора при длине волны 540-560 нм прямо пропорциональна концентрации билирубина в нем.

 

Линейность метода: 1,7 - 513 мкмоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – 1,7-21 мкмоль/л (25-37°С).

 

Концентрация общего билирубина сохраняется стабильной, при условии непопадании солнечного света на образцы, в сыворотке/ гепаринизированной или ЭДТА-плазме в течение 1 дня при комнатной температуре, при температуре хранения 2-8°С – в течение 7 дней, при температуре –20°С – в течение 3 месяцев.

 

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 540-560 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 25 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

4) Сыворотка крови/ гепаринизированная или ЭДТА-плазма;

5) Реагент 1 (детергент в ТРИС-буфере, рН 8,2 8 ммоль/л);

6) Реагент 2 (соляная кислота 30 ммоль/л, 2,4-дихлорфенол 1 ммоль/л, детергент, диазониевая соль);

7) Стандарт (раствор билирубина, 100 мкмоль/л);

8) Дистиллированная вода.

 

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Образец (например, сыворотка)	25 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	25 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	25 мкл	--
4. Реагент 1.	1 мл	1 мл	1 мл
Перемешать содержимое пробирок, инкубировать 5 мин при 37°С, или 10 мин при 20-25°С. Измерить оптическую плотность А1 против холостой пробы при длине волны 540-560 нм.
5. Реагент 2	250 мкл	250 мкл	250 мкл

 

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре или 5 мин при температуре 37°С. Измерить оптическую плотность А₂ опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 540-560 нм. Вычислить DА = А2 – А1 для образца и стандарта.

 

Расчет

Расчет по стандарту концентрации общего билирубина в сыворотке крови проводят по формуле:

DАоп С (мкмоль/л) = ----------- ´ Сст, DАст

где DА – разность оптических плотностей А₁ и А₂;

С_ст – концентрация стандарта (мкмоль/л).

 

Если концентрация общего билирубина превышает 513 мкмоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

 

Клинико-диагностическое значение: Билирубин – это продукт распада гемоглобина. Свободный (неконъюгированный) билирубин совершенно неполярен и почти нерастворим в воде, поэтому для транспортирования его в крови от селезенки к печени образуется комплекс с альбумином. В печени билирубин конъюгирует с глюкуроновой кислотой, а образующийся комплекс билирубин–глюкуроновая кислота (связанный билирубин) экскретируется в желчные протоки.

Гипербилирубинемия может бить вызвана увеличенным образованием свободного билирубина в результате гемолиза (гемолитическая/ прегепатитная желтуха), повреждения паренхимы печени (паренхиматозная/ интрагепатитная желтуха) или закупорки желчных протоков (обтурационная/ постгепатитная желтуха).

Хроническая врожденная гипербилирубинемия (преобладание свободного билирубина) называется синдромом Гилберта и встречается довольно часто.

Высокие уровни билирубина наблюдаются у 60-70% новорожденных из-за усиленного послеродового разрушения эритроцитов и отставания в активности ферментов деградации билирубина.

Общепринятые методы анализа определяют либо общий, либо прямой билирубин. Прямой билирубин – это конъюгированный, растворимый в воде билирубин. Следовательно, неконъюгированный (свободный) билирубин может быть оценен как разница между общим и прямым билирубином.

 

ТЕМА 9. БИОХИМИЯ КРОВИ И МОЧИ

Лабораторная работа № 17.