Определение концентрации кальция в сыворотке крови

 

 

Принцип метода: Кальций в растворе при нейтральном значении рН образует с красителем Арсеназо III окрашенный комплекс синего цвета.

Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации кальция в нем.

 

Линейность метода: 0,01-6,25 ммоль/л.

Норма: 2,15-2,57 ммоль/л.

 

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 650 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 20-37°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 10 мкл и 1000 мкл;

4) Сыворотка крови;

5) Реагент (Арсеназо III 120 мкмоль/л в фосфатном буфере, рН 7,5 – 50 ммоль/л);

6) Стандарт (раствор Са²⁺ 2,5 ммоль/л).

 

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Сыворотка	10 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	10 мкл
3. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

 

Перемешать содержимое в пробирках, инкубировать 2 минуты. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 650 нм. Окраска раствора стабильна в течение 40 минут.

 

Расчет

Расчет по стандарту концентрации кальция в сыворотке проводят по формуле:

 

DАоп С (ммоль/л) = ----------- ´ Сст, DАст

 

где DА_оп / DА_ст – оптическая плотность пробы или стандарта;

С_ст – концентрация стандарта.

 

Если концентрация кальция превышает 6,25 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Для измерений рекомендуется использовать одноразовую посуду. Следовые количества хелатирующих веществ (например, ЭДТА), которые могут присутствовать в детергентах, препятствуют образованию окрашенного комплекса.

 

Клинико-диагностическое значение: Содержание кальция в сыворотке крови повышается выше нормы при массивных распадах костей, гиперпаратиреоидизме, гипервитаминозе D.

Концентрация кальция в сыворотке падает при гипопаратиреоидизме, гиповитаминозе D, а также при некоторых почечных тубулопатиях и синдроме мальабсорбции.

 

 

Лабораторная работа № 24.

Определение концентрации фосфора в сыворотке крови

 

 

Принцип метода: Неорганический фосфор (фосфаты) образует с молибденовой кислотой фосфорномолибденовую гетерополикислоту. Последняя реагирует с красителем малахитовым зеленым с образованием комплекса, окрашенного в сине-фиолетовый цвет.

Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации фосфора в нем. Белок сыворотки не мешает проведению реакции. Детергент способствует устойчивости образовавшегося комплекса в растворе.

 

Линейность метода: до 3 ммоль/л.

Норма: 1-2 ммоль/л неорганического фосфора.

 

 

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 600-650 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 20-37°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 20 мкл и 1000 мкл;

4) Сыворотка крови;

5) Цветной реагент (Малахитовый зеленый 0,3 %, молибдат аммония 2,1% в 5 н. соляной кислоте);

6) Раствор детергента (Твин 20, 1,5%);

7) Стандарт (раствор КН2РО4, 1,0 ммоль/л);

8) Деионизированная вода.

 

 

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Сыворотка	20 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	20 мкл
3. Деионизирован-ная вода	1,5 мл	1,5 мл	1,5 мл
4. Цветной реагент	2 мл	2 мл	2 мл
5. Раствор детергента	1 капля	1 капля	1 капля

 

Перемешать содержимое в пробирках, инкубировать 15 минут. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 600-650 нм. Окраска раствора стабильна в течение 20 минут.

 

Расчет

Расчет по стандарту концентрации фосфора в сыворотке проводят по формуле:

 

DАоп С (ммоль/л) = ----------- ´ Сст, DАст

 

где DА_оп / DА_ст – оптическая плотность пробы или стандарта;

С_ст – концентрация стандарта.

 

Если концентрация фосфора превышает 3,0 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Для измерений рекомендуется использовать одноразовую посуду

 

Клинико-диагностическое значение: Неорганический фосфор увеличивается в сыворотке при почечной недостаточности, гипопаратиреоидизме, передозировке витамина D. Уменьшение концентрации фосфора в сыворотке наблюдается при рахите, гиперпаратиреоидизме, почечных тубулопатиях и синдроме мальабсорбции.

 

ПРИЛОЖЕНИЕ