Определение концентрации мочевины в сыворотке крови ферментативным методом

 

 

Принцип метода: Мочевина под действием фермента уреазы распадается на углекислый газ и аммиак. Аммиак реагирует с хромогеном (фенол-гипохлорит) в присутствии акселератора реакции нитропруссида натрия с образованием синего красителя:

 

Уреаза Мочевина + Н2О ----------------> 2 NН3+ СО2

Нитропруссид NН3 + Фенол-гипохлорит ------------------------> Индофенол

 

Интенсивность окраски раствора при длине волны 500-650 нм прямо пропорциональна концентрации мочевины в нем.

 

Линейность метода: до 26,8 ммоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – 2,5-6,4 ммоль/л (37°С).

 

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 500-650 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 10 мкл, 2,5 мл;

4) Сыворотка крови;

5) Реагент (фенол-гипохлорит, нитропруссид натрия, уреаза в буфере, рН 6,5);

6) Стандарт (раствор мочевины 10,6 ммоль/л);

7) Дистиллированная вода.

 

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Сыворотка	10 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	10 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	10 мкл	--
4. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

 

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 20 мин при температуре 37°С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 500-650 нм.

 

Расчет

Расчет по стандарту концентрации мочевины в сыворотке крови проводят по формуле:

 

DАоп С (ммоль/л) = ----------- ´ Сст, DАст

 

где DА_{оп / ст} – оптическая плотность опытной и стандартной проб,

соответственно;

С_ст – концентрация стандарта (ммоль/л).

 

Если концентрация мочевины превышает 26,8 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

 

Клинико-диагностическое значение: Отклонения от нормы содержания мочевины в сыворотке крови зависят от скорости ее биосинтеза и выделения.

Увеличение концентрации мочевины в сыворотке крови – один из главных признаков нарушения функции почек. Из фракций остаточного азота раньше всего повышается уровень мочевины и может достигать 90% от всего остаточного азота.

Повышение концентрации мочевины в сыворотке крови может носить и внепочечный характер: при потере жидкости организмом, при усиленном распаде белков (острая желтая атрофия печени, тяжелые заболевания).

Уменьшение содержания мочевины в сыворотке крови наблюдается при заболеваниях печени (паренхиматозная желтуха, цирроз) по причине нарушенного синтеза мочевины в гепатоцитах.

 

Лабораторная работа № 14.

Определение концентрации креатинина в биологических жидкостях кинетическим методом

 

 

Принцип метода: Кинетический метод без депротеинирования (осаждения белка) основан на цветной реакции Яффе (Jaffe). Креатинин в щелочной среде образует с пикриновой кислотой окрашенный (оранжевый) комплекс.

Изменение оптической плотности пробы за фиксированное время при длине волны 490-510 нм прямо пропорционально концентрации креатинина в ней.

 

Линейность метода: до 1,33 ммоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – мужчины – 53-97 мкмоль/л (25-37°С);

женщины – 44-80 мкмоль/л (25-37°С).

Суточная моча – 88,5-133 ммоль/л.

 

Концентрация креатинина сохраняется стабильной в образцах при температуре хранения 2-8°С в течение 24 часов.

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 490-510 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 50 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

4) Сыворотка крови/ суточная моча. Мочу предварительно развести деионизированной водой в соотношении 1:50. Кроме сыворотки можно использовать гепаринизированную плазму;

5) Реагент 1 (гидроксид натрия 160 ммоль/л);

6) Реагент 2 (пикриновая кислота 4,0 ммоль/л);

7) Стандарт (раствор креатинина 177 мкмоль/л);

8) Дистиллированная вода.

 

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Образец (например, сыворотка)	50 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	50 мкл
3. Дистиллирован-ная вода	--	50 мкл	--
4. Реагент 1.	1 мл	1 мл	1 мл
Перемешать содержимое пробирок
5. Реагент 2	250 мкл	250 мкл	250 мкл

 

Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Точно через 60 секунд измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 490-510 нм (А₁). Повторить измерение через 60 секунд (А₂). Рассчитать изменение оптической плотности за минуту для опытной и стандартной проб:

DА_оп = А_2оп – А_1оп;

DА_ст = А_2ст – А_1ст.

 

Расчет

Расчет по стандарту концентрации креатинина в сыворотке (плазме) проводят по формуле:

 

DАоп С (мкмоль/л) = ----------- ´ Сст, DАст

 

где DА_{оп / ст} – изменение оптической плотности в минуту;

С_ст – концентрация стандарта.

 

Расчет по стандарту концентрации креатинина в суточной моче проводят по формуле:

 

DАоп С (ммоль/л) = ----------- ´ Сст ´ 50, DАст

 

где DА_{оп / ст} – изменение оптической плотности в минуту;

С_ст – концентрация стандарта;

50 – коэффициент разведения.

 

Если концентрация креатинина превышает 1,33 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Нельзя анализировать иктеричные образцы, так как билирубин искажает результаты измерений.

 

Клинико-диагностическое значение: Определение концентрации креатинина проводят для исследования функции почек. При значительном ухудшении функции почек концентрация креатинина в сыворотке увеличивается.

У здоровых людей концентрация креатинина в сыворотке относительно постоянна и мало зависит от пола, возраста, диеты, так как образование креатинина в мышцах как конечного продукта метаболизма относительно постоянно.

Клиренс эндогенного креатинина используют в качестве меры клубочковой фильтрации.