Основы метода полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации любого организма, специфичный только для данного вида организмов, среди огромного количества других участков и многократно размножить эго.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была открыта в 1983 г. и американский журнал “Science” назвал это открытие самым выдающимся открытием последних лет.

С быстротой молнии метод распространился по всему миру. ПЦР используется для проведения научных и практических исследований. Но прежде всего метод нашел широкое применение в области микробиологической диагностики.

 

Принцип метода: Метод ПЦР основан на естественной репликации ДНК, включающей расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплиментарное дополнение обеих.

Репликация ДНК в ПЦР-методе может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках ДНК. Суть метода заключается в том, что, маркируя такими блоками специфический только для данного вида организмов участок ДНК, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок.

Для того чтобы осуществить такой процесс in vitro (в пробирке), используют две генетические пробы, называемые праймерами, которые служат в качестве затравки для синтеза выбранного участка ДНК. При внесении в исследуемую пробу праймеры подобно паре генетических детективов прочесывают раствор в поисках участка, которому они комплементарны и, следовательно, способны присоединится, образовав двунитчатый стартовый участок. После присоединения праймеров (отжиг) начинается воспроизведение специфического фрагмента ДНК с помощью фермента Taq -полимеразы. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации – это и есть цепная полимеразная реакция в ПЦР-методе. В результате ее количество копий специфического участка ДНК увеличивается в геометрической прогрессии и через 25 циклов амплификации синтезируются 10⁶ копий фрагмента. В течение 30-40 циклов нарабатывается количество ДНК, достаточное, чтобы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле. Протекание ПЦР (т.е. переход от стадии к стадии и от цикла к циклу) регулируется изменением температуры рабочей смеси:

А) температура денатурации ДНК является функцией ионной силы используемого буфера;

Б) температура отжига – температура, при которой возможно связывание праймера с матрицей, зависит от длины праймера и его первичной структуры;

В) температура элонгации, зависит от типа используемой ДНК-полимеразы.

 

Чувствительность: очень высокая: около 10 бактериальных клеток, в то время как чувствительность иммунологических и микроскопических тестов колеблется в пределах 10³-10⁶ клеток.

Специфичность: 100 %.

Для ПЦР-анализа пригоден любой материал, в том числе и гистологические препараты.

Количество исследуемого материала составляет несколько десятков мл, но при низкой концентрации возбудителя может быть увеличен в сотни и тысячи раз за счет необходимости экстракции ДНК и РНК.

Исследуемый материал можно дезинфицировать химической или термической обработкой в момент его забора, и, следовательно исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.

 

Оборудование и реагенты:

В настоящее время метод ПЦР автоматизирован, довольно прост в исполнении и доступен любой молекулярно-биологической лаборатории. Для получения ответа на интересующие вопросы диагностики достаточно лишь смешать в пробирке:

1) ДНК-мишень, 10 нг/мкл;

2) Праймеры – короткие олигонуклеотиды (20-30 нукл.) – затравки, комплиментарные 3'-концевым последовательностям антипараллельных цепей ДНК гена, 2 шт., концентрация каждого 5 пмоль/мкл;

3) Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты 4 типов, смесь 2мМ;

4) Taq- ДНК-полимераза термостабильная, 5 Е/мкл (название свое фермент получает по имени штамма-продуцента);

5) ПЦР-буфер (TРИС-буфер (pH 8.4), 200мМ; КCl, 500мМ; 0.01% Tween 20);

6) раствор MgCl₂,25mМ;

7) Вода деионизованная;

8) Программируемый термостат (амплификатор), который по заданной программе автоматчески проводит смену температур реакционной среды.

Определение можно проводить в разнообразном клиническом материале (кровь, сыворотка, лаважные массы, мокрота, слюна, желудочный сок, биопсийный материал, мазки, смывы) и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва).

Проведение анализа

ПЦР состоит из 3 основных процедур:

1) подготовки исследуемой пробы материала (изоляция ДНК или РНК);

2) собственно ПЦР;

3) детекция продукта ПЦР (амплифицированной ДНК).

Пятью основными компонентами ПЦР являются следующие:

а) фермент Taq -ДНК-полимераза;

б) пара олигонуклеотидных праймеров;

в) 4 типа дезоксинуклеозидтрифосфатов (dАТФ, dГТФ, dЦТФ, dТТФ);

г) копируемая ДНК;

д) ионы Mg⁺².

Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и минеральное масло.

Поскольку праймеры каждый раз встраиваются в амплифицируемые фрагменты ДНК-матрицы (амплификоны), то они в реакционной смеси ПЦР присутствуют в избытке.

Как правило, праймеры для ПЦР-детекции инфекционных возбудителей создают на консервативные участки их ДНК, которые редко подвергаются генетическим перестройкам. Поиски таких участков осуществляют при помощи специальных компьютерных программ.

Результаты получают через несколько часов, то есть в течение одного рабочего дня.

Рассмотрим ПЦР-анализ на примере амплификации участка плазмиды pBluescript II SK, размером ~ 180 п.н

 

ПЦР проводится в объеме 10-100 мкл.

Рабочая концентрация праймеров в реакционной смеси составляет 0.2-1 пмоль/мкл

Количество матричной ДНК, добавляемой в реакцию колеблется в пределах от 10 до 1000 нг.

Рабочая концентрация Taq -ДНК-полимеразы в реакционной смеси составляет 0.01-0.05 Е/мкл

Считается, что "скорость" достраивания у Taq -ДНК-полимеразы составляет 1000 нуклеотидов в минуту

Методика:

1. В стерильном эппендорфе на 0,5 мл смешать указанные выше компоненты, довести объем при помощи деионизованной воды до 20 мкл, аккуратно перемешать реакционную смесь пипетированием.

2. Наслоить на реакционную смесь немного минерального масла (приблизительно 30 мкл).

3. Поместить пробирки в амплификатор. Реакцию проводить в следующем режиме:

 

Температура, С	Стадия	Время	Число циклов
	Денатурация	40 сек
	Отжиг	30 сек
	Элонгация	30 сек
		10 мин
		хранение

 

4. Детекция продуктов амплификации проводится методом электрофореза на агарозном геле.

Анализ продуктов ПЦР должен производиться в изолированной комнате сотрудником лаборатории, не производящим обработки клинических образцов и операций с реакционной смесью.

Работать следует только в одноразовых перчатках и сменной обуви.

Чувствительность ПЦР может достигать математически возможного предела (детекция 1 копии ДНК-матрицы), поэтому существует высокая степень опасности получения ложно-положительного результата в силу переноса через предметы и реагенты как самой ДНК-матрицы (реже), так и аплификонов (очень часто), получаемых в больших количествах во многих пробирках в течение ежедневной работы. В связи с этим нами разработаны специальные требования к планировке и режиму работы ПЦР-генодиагностической лаборатории. Поэтому детекция продуктов ПЦР должна проводиться в изолированной комнате сотрудником, не производящим обработку клинических образцов и не готовящим реактивы для ПЦР. Приготовление основных растворов также должно производится в отдельной чистой комнате. Все растворы должны храниться и использоваться в небольших порциях.

Клинико-диагностическое значение: ПЦР в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей многих инфекционных заболеваний за счет амплификации специфических для этих возбудителей фрагментов ДНК.

ПЦР позволяет обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим, микроскопическим) их выявление невозможно.

Тест-системы на основе ПЦР эффективны при диагностике трудно культивируемых, не культивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий. С этим приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, а также при тестировании объектов внешней среды.

Метод позволяет определять число копий возбудителя в пробе и тем самым контролировать виремию или бактеремию в процессе лечения.

Метод также пригоден для выявления носителей дефектных генов (например ген НbS серповидно-клеточной анемии).

ПЦР-диагностикумы, в отличие от иммунологических тест-систем, позволяют избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами, тем самым обеспечивая абсолютную специфичность определения патогенного организма.