Разделение белков сыворотки крови методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы

Принцип метода: Белки являются амфотерными электролитами. Направление движения белков в электрическом поле зависит от рН среды. Коллоидные частицы белка перемещаются в электрическом поле постоянного тока к аноду – в щелочной среде, к катоду – в кислой среде.Разделение белков сыворотки обычно проводят в буферном растворе при рН 8,6 – 8,9. В качестве носителя используют пленки из ацетата целлюлозы. В этих условиях заряженные белки сыворотки крови перемещаются по смоченным пленкам из ацетата целлюлозы в направлении анода со скоростью, зависящей от величины заряда и относительной молекулярной массы белка. Этот след представляет собой дорожку, на которой после окрашивания ясно видны места концентрации белков различных фракций. Наиболее быстро движутся альбумины, затем a₁-, a₂-, b-глобулины, и, наконец, g-глобулины. По этим следам (дорожкам) можно определить содержание белка в различных белковых фракциях пробы. Методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы можно получить 5 и более белковых фракций.

Нормальные величины белковых фракций зависят от вида применяемого красителя:

 

Белковые фракции	Окраска электрофореграммы
Пунцовый С	Амидо черный
1. Альбумины	52% (46,9-61,4)	60,2% (50,3-70,1)
2. a1-Глобулины	3,3% (2,2-4,2)	4,4% (2,7-6,1)
3. a2-Глобулины	9,4% (7,9-10,9)	12,3% (9,4-15,2)
4. b-глобулины	14,3% (10,2-18,3)	13,0% (7,7-18,0)
5. g-Глобулины	21,4% (17,6-25,4)	20,1% (15,2-25,0)

Оборудование и реагенты:

1) Аппарат для электрофореза;

2) Источник постоянного тока;

3) Денситометр;

4) Веронал-мединаловый буфер, рН 8,6;

5) Раствор амидо черного для окрашивания электрофореграммы (амидо черный 250 мг в 100 мл 7% уксусной кислоты);

6) Раствор для отмывания (5-7% уксусная кислота)

7) Раствор для просветления пластинок из ацетата целлюлозы (смесь этанола, уксусной кислоты и глицерина);

8) Сыворотка крови;

9) Дистиллированная вода.

Просветления пластинок из ацетата целлюлозы можно достигнуть также, погрузив пластинки на 2-3 минуты в глицерин или вазелиновое масло.

Проведение анализа

1. Сухие пластинки из ацетата целлюлозы помечают карандашом, а затем осторожно кладут на поверхность буфера для электрофореза так, чтобы они поглощали жидкость только снизу с помощью капиллярных сил. При быстром погружении пластинки в буфер в порах ацетата целлюлозы может остаться воздух.

2. Извлекают пластинки из буферного раствора и аккуратно зажимают их между листами плотной фильтровальной бумаги, не допуская высыхания пластинок. О высыхании свидетельствует появление белых пятен на поверхности пластинки. В этом случае пропитывание буфером следует повторить (см. пункт 1).

3. Влажную пластинку закладывают в рамку и помещают в электрофоретическую камеру.

4. С помощью апликатора на поверхность пластинки с катодного краю наносят образец – 0,2-0,4 мл сыворотки крови.

5. Сразу после нанесения образцов включают электрический ток.

Для кратковременного электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы лучшие результаты получаются при стабильном напряжении. Как правило, для пластинок толщиной около 120 мкм сила тока не должна превышать 0,5 мА на 1 см ширины пластинки. Для более толстых пластинок (250-300 мкм) сила тока может достигать 1мА на 1 см ширины пластинки. Применив высокий градиент напряжения (30-40 В на 1 см) можно получить четкое разделение фракций белка за короткий промежуток времени (20-30 минут).

 

6. После отключения тока пластинки осторожно переносят в красящий раствор на 5 минут.

7. Затем пластинки отмывают до отбеливания фона в 5-7% растворе уксусной кислоты дважды по 3 минуты. Промывают 3 раза дистиллированной водой. Просушивают между листами фильтровальной бумаги.

8. Проводят просветление пластинок. Для этого помещают пластинки на 30 секунд в 90° этиловый спирт. Затем помещают их в осветляющий раствор на 30 секунд. Наклеивают на стекло и помещают в сухожаровой шкаф на 5 минут при температуре 100°С.

9. Высушенную пластинку сканируют на денситометре придлине волны 600 нм, характерной для красителя амидо черного.

Расчет

Данные о содержании белка в белковых фракциях сыворотки крови могут быть представлены как в форме процентного распределения белка по фракциям, так и в форме содержания белка в отдельных фракциях в г/л (для этого предварительно в крови определяют содержание общего белка биуретовым методом).Результаты измерения заносят в таблицу:

 

Белковые фракции	Нормальные величины, %	Полученные величины, %	Полученные величины, г/л
1. Альбумины	60,2% (50,3-70,1)
2. a1-Глобулины	4,4% (2,7-6,1)
3. a2-Глобулины	12,3% (9,4-15,2)
4. b-глобулины	13,0% (7,7-18,0)
5. g-Глобулины	20,1% (15,2-25,0)
Концентрация общего белка в сыворотке крови – ______ г/л

Клинико-диагностическое значение: Электрофорез белков сыворотки крови имеет диагностическое значение в наблюдении за динамикой патологического процесса и оценке эффективности медикаментозного лечения.

Увеличение содержания a-глобулинов в сыворотке характерно для острых воспалительных заболеваний, так ка в данную фракцию входят белки острой фазы.

Во фракцию a-глобулинов входит также и большинство гликопротеинов крови. Поэтому ее содержание увеличивается при различных хронических заболеваниях, раке, травмах, ревматизме и инфаркте миокарда.

Повышение b-глобулинов в сыворотке чаще наблюдается при гиперлипопротеинемиях различного происхождения, так как в эту фракцию входят липопротеины.

Фракция g-Глобулинов состоит из иммуноглобулинов и увеличивается при заболеваниях, связанных с интенсивными иммунными процессами, а также при миеломных болезнях.

Гипогаммаглобулинемия может носить врожденный характер или быть обусловленной истощением иммунной системы (рак, хронические воспалительные процессы, аллергические заболевания, СПИД).

 

ТЕМА 2. ФЕРМЕНТЫ

Лабораторная работа № 3.