Тема 4. Введение в обмен веществ.

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН

Лабораторная работа № 5

Определение продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови

 

 

Принцип метода: Продукты перекисного окисления липидов (малоновый альдегид) образуют с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) окрашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом.

Разность интенсивности окраски раствора при двух длинах волн прямо пропорциональна концентрации продуктов перекисного окисления липидов в нем.

 

Норма: 2,12-4,8 мкмоль/л.

 

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 535 нм и 570 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 20-37°С;

2) Секундомер;

3) Водяная баня на 100°С;

4) Центрифуга на 3000 об/мин (1800 g);

5) Автоматические пипетки с переменным объемом на 100-500 мкл и 1-3 мл;

6) Сыворотка крови;

7) Реагент (тиобарбитуровая кислота, 5 г/л);

8) Ортофосфорная кислота (раствор 1,4 %);

9) п -Бутанол;

10) Дистиллированная вода.

 

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба
1. Ортофосфорная кислота	1 мл	1 мл
2. Сыворотка	100 мкл	--
3. Дистиллированная вода	--	100 мкл
4. Реагент	400 мкл	400 мкл
Пробирки накрыть колпачками и поместить в водяную баню на 45 мин при 100°С. После кипячения пробирки охладить в холодной воде 3-5 минут.
5. п -Бутанол	1,5 мл	1,5 мл

 

Перемешать содержимое в пробирках, интенсивно встряхивая их до образования однородной белой суспензии розового оттенка. Затем пробирки центрифугировать 10 мин при 3000 об/мин. Сразу после центрифугирования отобрать по 1 мл супернатанта в чистые пробирки. Измерить оптическую плотность опытной пробы против холостой пробы при двух длинах волн 535 нм и 570 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска раствора стабильна в течение 1,5 часа после центрифугирования.

 

Расчет

Расчет содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке проводят по формуле:

 

А535 – А570 С (мкмоль/л) = ------------------------- ´ 15, 0,156

где А₅₃₅ и А₅₇₀ – опт.плотность пробы при длине волны 535 нм и 570 нм,

соответственно;

0,156 – коэффициент молярной экстинции комплекса малонового

альдегида с тиобабитуровой кислотой;

15 – коэффициент разведения сыворотки.

 

Клинико-диагностическое значение: Образующиеся в процессе развития ПОЛ ненасыщенные альдегиды и малоновый альдегид являются мутагенами и обладают выраженной цитотоксичностью: подавляют активность гликолиза и окислительного фосфорилирования, ингибируют синтез белка и нуклеиновых кислот, окисляют белковые SH-группы, ингибируют различные цитозольные и мембраносвязанные ферменты.

 

ТЕМА 5. ХИМИЯ И ОБМЕН УГЛЕВОДОВ

Лабораторная работа № 6.

Определение концентрации глюкозы в крови ферментативным методом (с помощью прибора контроля уровня глюкозы в крови ONE TOUCH BASIC PLUS)

 

 

Принцип метода: Система контроля уровня глюкозы в крови ONE TOUCH BASIC PLUS предназначена для определения уровня глюкозы в цельной крови в домашних и клинических условиях. Система включает в себя прибор ONE TOUCH BASIC PLUS, тест-полоски, ланцеты и флакон с контрольным раствором.

Тест основан на глюкозооксидазной реакции, специфичной для глюкозы. На любые другие сахара тест не реагирует. После нанесения крови на тест-полоску компоненты последней реагируют с кровью в следующей последовательности:

 

Глюкозооксидаза Глюкоза + 2Н2О + О2 --------------------------> Глюконовая кислота+ Н2О2

 

Пероксид водорода реагирует с хромогеном (4-аминоантипирин) с образованием красителя хинонимина:

 

Пероксидаза Н2О2+ 4-Аминоантипирин + ГБС ------------------------> Хинонимин + 4Н2О

 

Интенсивность окраски пятна при длине волны 505 нм прямо пропорциональна концентрации глюкозы в нем.

 

Линейность метода: до 33,3 ммоль/л.

Норма:

Цельная кровь – 3,3-5,5 ммоль/л (18-25°С);

Сыворотка – 3,8-6,1 ммоль/л.

 

Оборудование и реагенты:

1) прибор ONE TOUCH BASIC PLUS;

2) тест-полоски;

3) ланцеты;

4) Стандарт (контрольный раствор 4,8-6,8 ммоль/л).

 

Проведение анализа

1. Включить прибор. На экране автоматически появится результат предыдущего теста.

2. Установить код нажатием кнопки «С». Номер кода на приборе должен совпадать с номером кода на флаконе с тест-полосками.

3. Ввести тест-полоску в прибор до упора.

4. Проколоть палец с помощью нового стерильного ланцета.

5. Аккуратно нанести каплю крови на зону теста.

6. Получить точный результат через 45 секунд (дата, время, уровень глюкозы в ммоль/л).

 

Хотя система ONE TOUCH BASIC PLUS требует малого количества крови, очень важно, чтобы капля крови была достаточно большой и закрывала полностью зону теста.

Данный прибор не предназначен для диагностики сахарного диабета и для измерения уровня глюкозы в крови у новорожденных детей в возрасте до 4 недель.

Если результаты анализа ниже 3,3 ммоль/л, на экране появится надпись «опасно врач» – следует немедленно принять меры вместе с лечащим врачем при гипогликемии.

Если результат выше 33,3 ммоль/л, на экране прибора появится надпись «НI опасно врач», что указывает на недопустимо высокую концентрацию глюкозы в крови (острая гипергликемия) и требуется немедлнное обращение к врачу.

 

Для проверки правильности показаний прибора (минимум 1 раз в неделю) можно использовать проверочную тест-полоску или контрольный раствор:

 

 

Контроль с помощью проверочной тест-полоски	Контроль с помощью контрольного раствора
1. Включить прибор	1. Включить прибор
2. Ввести проверочную полоску стороной 1 вверх	2. Убедится, что номер на экране совпадает с номером на флаконе с тест-полосками. Вставить тест-полоску.
3. При появлении записи на экране «Нанеси пробу» извлечь проверочную полоску	3. Хорошо встряхнуть флакон с контрольным раствором.
4. Когда на экране прибора появится надпись «введи стор.2», ввести проверочную полоску стороной 2.	4. Нанести каплю контрольного раствора на зону теста
5. Прибор покажет результат.	5. Прибор покажет результат через 45 секунд.

 

Клинико-диагностическое значение: Увеличенные уровни глюкозы в крови (гипергликемия) характерны для сахарного диабета, гиперфункции щитовидной железы, гипофиза и надпочечников.

Концентрация глюкозы в крови ниже нормы (гипогликемия) наблюдается при инсулин-секретирующих опухолях, микседеме, гипофункции гипофиза, гипофункции надпочечников, и в случае введения пациенту сверхбольшой дозы инсулина.

 

Лабораторная работа № 7.